一种生产复合类胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法和应用与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种生产复合类胡萝卜素(α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、δ-胡萝卜素和番茄红素)的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术：

类胡萝卜素可成为重要的维生素A原外，还具有抗癌变、增加免疫力、延缓衰老的作用。番茄红素ε-环化酶只在植物中有发现，用于合成δ-胡萝卜素和α-胡萝卜素。近来有研究发现α-胡萝卜素具有特异抗癌症转移的能力。由于大部分植物和微生物中β-胡萝卜素积累较普遍，但α-胡萝卜素占有的比例较低。并且现有微生物合成主要针对β-胡萝卜素，尚未见在微生物中对α-胡萝卜素进行有效合成，香蕉果实中含有大量的α-胡萝卜素和β-胡萝卜素，因此，利用植物特有的合成α-胡萝卜素的番茄红素ε-环化酶制备生产α-胡萝卜素及其它类胡萝卜素是一条相对安全与及有效的途径。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种香蕉番茄红素ε-环化酶及其编码基因。

申请人研究发现与其他植物相比，香蕉果肉具有高比例的α-胡萝卜素(30-60％)和β-胡萝卜素积累特性。在植物代谢途径中番茄红素由番茄红素ε-环化酶(LCYE)环化生成δ-胡萝卜素，后由番茄红素β-环化酶(LCYB)的环化作用生成α-胡萝卜素。同时番茄红素也可直接由番茄红素β-环化酶(LCYB)环化生成β-胡萝卜素。

本发明的香蕉番茄红素ε-环化酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该香蕉番茄红素ε-环化酶可环化番茄红素形成δ-胡萝卜素。番茄红素β-环化酶可分别环化δ-胡萝卜素和番茄红素分别经形成α-胡萝卜素和β-胡萝卜素。

一种编码上述的香蕉番茄红素ε-环化酶的香蕉番茄红素ε-环化酶基因。优选，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供本发明的香蕉番茄红素ε-环化酶在催化形成复合类胡萝卜素中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种生产复合类胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法。

本发明的生产复合类胡萝卜素的基因工程菌，是通过以下方法构建的，将上述的香蕉番茄红素ε-环化酶基因与表达载体连接，然后转化到含有LYC-LCYB1质粒的工程菌中，得到生产复合类胡萝卜素的基因工程菌；

所述的LYC-LCYB1质粒是通过以下方法构建的：

利用上游引物MaLCYBF：5’-TATCATCGATAAGCTTATGGATACGCTGCTTAGAAC-3’和下游引物MaLCYBR：5’-TACCGCATTAAAGCTTCTAATTTTTCTCTCGTAGC-3’PCR扩增香蕉cDNA，得到香蕉番茄红素β-环化酶基因MaLCYB；将其利用同源重组酶连接到经HindIII限制性内切酶切好的pAC-LYC载体上，得到LYC-LCYB1质粒。

优选，所述的表达载体为表达载体pBluescript SK，所述的含有LYC-LCYB1质粒的工程菌为含有LYC-LCYB1质粒的大肠杆菌DH5α。

一种根据上述的构建方法构建得到的生产复合类胡萝卜素的基因工程菌。

本发明的第四个目的是提供本发明的生产复合类胡萝卜素的基因工程菌在制备复合类胡萝卜素中的应用。

本发明的复合类胡萝卜素的制备方法，其特征在于，将生产复合类胡萝卜素的基因工程菌进行发酵培养，然后对发酵培养物进行分离得到复合类胡萝卜素。

所述的制备方法，优选包括以下步骤：将生产复合类胡萝卜素的基因工程菌接种到LB液体培养基中，28-30℃振荡培养1-4d，得到发酵培养物，离心，收集菌体，然后用体积比为2:1的氯仿-甲醇进行萃取，收集下层有机相，干燥该有机相后得到复合类胡萝卜素。

本发明利用在植物代谢途径中合成δ-胡萝卜素、α-胡萝卜素及β-胡萝卜素的合成需要的番茄红素ε-环化酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)和番茄红素β-环化酶，将香蕉番茄红素ε-环化酶基因与表达载体连接，然后转化到含有LYC-LCYB1质粒的工程菌中，得到生产复合类胡萝卜素(α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、δ-胡萝卜素和番茄红素)的基因工程菌。

利用本发明的生产复合类胡萝卜素的基因工程菌经28℃发酵培养3d，可分别产生0.75、0.21、0.08、0.1mg/L的α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、δ-胡萝卜素和番茄红素。利用本发明的基因工程菌可直接从菌体中获得大量的复合类胡萝卜素并含有高比例的α-胡萝卜素，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是复合类胡萝卜素的液相图，A为α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、δ-胡萝卜素和番茄红素的标准品的液相图，B为实施例1制备的化合物1(复合类胡萝卜素)的液相图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

申请人研究发现与其他植物相比，香蕉(Musa nana Lour.)可积累高比例的α-胡萝卜素和β-胡萝卜素，并从香蕉中克隆到可环化番茄红素生成δ-胡萝卜素的香蕉番茄红素ε-环化酶的编码基因(MaLCYE，香蕉番茄红素ε-环化酶基因)，因此构建该基因的表达载体，转入含有LYC-LCYB1质粒的工程菌中，获得可大量积累复合类胡萝卜素的生产复合类胡萝卜素的基因工程菌。

以下使用的LB固体培养基的配方为：10g/L胰蛋白胨(Tryptone)，5g/L酵母提取物(Yeast extract)，10g/L氯化钠(NaCl)，15～20g/L琼脂粉，用10M NaOH调整pH值到7.4，余量为水；121℃，灭菌30min，温度降至55℃左右(不烫手)时，加入终浓度为34mg/L的氯霉素和50mg/L的氨苄青霉素，倒平板，保存备用；LB液体培养基的配方为：10g/L胰蛋白胨(Tryptone)，5g/L酵母提取物(Yeast extract)，10g/L氯化钠(NaCl)，用10M NaOH调整pH值到7.4，余量为水；121℃，灭菌30min，温度降至55℃左右(不烫手)或冷却后，加入终浓度为34mg/L的氯霉素和50mg/L的氨苄青霉素，保存备用。

以下对实施例的具体步骤进行说明：

a)香蕉RNA的提取及cDNA的获得：

香蕉RNA提取采用CTAB的方法进行。具体步骤为：取1g用液氮磨碎的香蕉果实，加入4mL 65℃预热的CTAB溶液(100mM Tris-HCl(pH 8.0)，2M NaCl，25mM EDTA，2％CTAB，2％PVP，0.5g/L亚精胺(Spermidine))和70μLβ-巯基乙醇混匀，加入4mL的氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋20秒，15℃、10000g离心15分钟，取上清，重复加入4mL的氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋20秒，15℃、10000g离心15分钟，取上清，加入1/5体积的12M LiCl，混匀，于4℃放置过夜，4℃、10000g离心30分钟，去上清，在透明或白色沉淀中加入400μL65℃预热的SSTE溶液(1M NaCl，0.5％SDS，10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA)溶解，加入400μL氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋20秒，15℃、10000g离心10分钟，取上清，重复加入400μL氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋20秒，15℃、10000g离心10分钟，取上清，加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，混匀，-80℃放置1个小时，4℃、10000g离心30分钟，去上清，加入DEPC水溶解RNA，提取得到香蕉RNA，保存于-80℃。

将香蕉RNA逆转录成cDNA，采用TAKARA公司的PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒。取出-80℃冻存的香蕉RNA，待融化后，根据说明书加入DNA酶后，42℃消化DNA 2分钟，再加入反转录试剂，37℃15分钟，85℃5秒；得到逆转录的cDNA。

b)LYC-LCYB1质粒的构建

利用生物信息学分析方法，在香蕉基因组数据库中搜索番茄红素β-环化酶基因(MaLCYB)，得到1条候选序列，根据该序列信息，设计用于扩增香蕉番茄红素β-环化酶基因(MaLCYB)全长序列的引物序列为：上游引物MaLCYBF：5’-TATCATCGATAAGCTTATGGATACGCTGCTTAGAAC-3’和下游引物MaLCYBR：5’-TACCGCATTAAAGCTTCTAATTTTTCTCTCGTAGC-3’。

反应体系参照说明书，PCR扩增用Takara的PrimeSTAR Max Premix(2×)10μL，10μM上游引物MaLCYBF和10μM下游引物MaLCYBR各0.5μL，逆转录的cDNA模板0.1μL，加双蒸水补足20μL。PCR扩增程序为98℃30sec，1个循环；98℃15sec，60℃15sec，72℃30sec，36个循环；72℃10min，1个循环。由此扩增得到香蕉番茄红素β-环化酶基因(MaLCYB)全长序列，利用同源重组酶(Clontech)连接到经HindIII限制性内切酶切好的pAC-LYC载体(Addgene，Plasmid#53270)上，得到重组质粒LYC-LCYB1。

c)香蕉番茄红素ε-环化酶基因(MaLCYE)的克隆：

利用生物信息学分析方法，在香蕉基因组数据库中搜索番茄红素ε-环化酶基因(MaLCYE)，得到1条候选序列，根据该序列信息，设计用于扩增香蕉番茄红素ε-环化酶基因(MaLCYE)全长序列的引物序列为：上游引物MaLCYEF：5’-GAGCTCATGGAATGCTTAGGCCGCG-3’和下游引物MaLCYER：5’-GGGCCCTTACAGTGTGAGGTATG-3’。

PCR扩增反应体系参照说明书，PCR扩增用Takara的PrimeSTAR Max Premix(2×)10μL，10μM上游引物MaLCYEF和10μM下游引物MaLCYBR各0.5μL，逆转录的cDNA模板0.1μL，加双蒸水补足20μL。PCR扩增程序为98℃30sec，1个循环；98℃15sec，60℃15sec，72℃30sec，36个循环；72℃10min，1个循环。由此扩增得到香蕉番茄红素ε-环化酶基因(MaLCYE)全长序列，全长序列经限制性内切酶SacI和ApaI酶切后(37℃酶切反应2个小时)，连接到表达载体pBluescript SK(37℃限制性内切酶SacI和ApaI酶切2个小时)中，得到重组质粒pMaLCYE，送公司测序，香蕉番茄红素ε-环化酶基因(MaLCYE)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(其编码的香蕉番茄红素ε-环化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，确认序列正确后，利用热激法(42℃热激90秒)将该重组质粒pMaLCYE转入含有LYC-LCYB1质粒(含有欧文氏菌的crtE、crtB、crtI基因和香蕉的LCYB1基因)的大肠杆菌DH5α中，于37℃在LB固体培养基(含34mg/L浓度的氯霉素和50mg/L浓度的氨苄青霉素)上培养1天，挑取阳性单克隆于1mL的LB液体培养基中(含34mg/L浓度的氯霉素和50mg/L浓度的氨苄青霉素)，28-30℃，200转/分钟培养1天，至OD600值为1.0左右，保存于15％的甘油，放于-80℃冰箱备用，由此得到的生产复合类胡萝卜素(α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、δ-胡萝卜素和番茄红素)的基因工程菌，经过培养后可积累大量的复合类胡萝卜素。

d)复合类胡萝卜素组分的鉴定

取20μL上述保存的生产复合类胡萝卜素(α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、δ-胡萝卜素和番茄红素)的基因工程菌接种到25mL LB液体培养基(含有34mg/L浓度的氯霉素和50mg/L浓度的氨苄青霉素)中，于28℃培养3天(摇床转速250rpm)。培养后，12000g离心10分钟，得到菌体，加入氯仿：甲醇(体积比2:1)进行萃取，涡旋2分钟，12000g离心5分钟，收集下层有机相，用氮吹仪将有机相吹干，得到化合物1。对化合物1进行液相色谱分析(图1)，化合物1的保留时间(图1B)与α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、δ-胡萝卜素和番茄红素标准品的保留时间(图1A)一致，因此，确定化合物1为α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、δ-胡萝卜素和番茄红素的复合物。

e)培养体系的筛选

取20μL上述保存的生产复合类胡萝卜素的基因工程菌接种到25mL LB液体培养基(含有34mg/L浓度的氯霉素和50mg/L浓度的氨苄青霉素)中，分别于28℃、30℃培养1到4天(摇床转速250rpm)。培养后，12000g离心10分钟，得到菌体，加入氯仿：甲醇(体积比2:1)进行萃取，涡旋2分钟，12000g离心5分钟，收集下层有机相，用氮吹仪将有机相吹干，得到复合类胡萝卜素。复合类胡萝卜素的产量见表1，其中30℃下培养1天的复合类胡萝卜素产量较高，28℃培养3天后的α-胡萝卜素的产量最高。

表1不同培养体系下复合类胡萝卜素的产量比较