本发明涉及一种联产异戊二烯和1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程
技术领域：
：。技术背景异戊二烯(2-甲基-1,3-丁二烯)是目前公认的极具商业应用价值的重要化工平台化合物。异戊二烯是合成橡胶的主要单体，其用量占异戊二烯总产量的95％。此外，异戊二烯还广泛应用于医药或化工中间体、食品、粘合剂及航空燃料等领域。目前，异戊二烯的制备方法主要有石油基原料异戊烷、异戊烯脱氢法、化学合成法(包括丙烯二聚法、乙炔-丙酮法、异丁烯-甲醛法)和裂解C5馏分萃取蒸馏法等。然而，随着化石资源的日益枯竭和价额的不断攀升，原料供给问题必然成为制约异戊二烯生产的重要瓶颈。另外，化学法制备异戊二烯的过程中普遍存在能耗高、工艺复杂、对设备要求高、环境污染严重和产物收率低等问题，制约着异戊二烯工业化生产的发展。因此，寻找可持续的异戊二烯生产方式是今后异戊二烯工业生产的重要发展趋势。与传统化学法相比，以生物转化和生物催化为核心的微生物发酵法具有环境友好、利用廉价的可再生原料、可持续发展等优势。因此，微生物合成成为异戊二烯制备领域的重要研究方向。利用天然微生物合成异戊二烯的主要问题是产量低，无法满足工业生产的要求。因此，利用代谢工程构建基因工程菌成为提高异戊二烯产量的重要手段[1]。然而，代谢工程改造常常不能得到预期的效果，这与人们对细胞内的代谢过程和调控过程还不够了解有着很大的关系。异戊二烯生物合成中均需要辅酶的参与，辅酶代谢与物质代谢一样，在发酵过程中占有重要地位。从葡萄糖合成异戊二烯的化学反应方程式：1.5C6H12O6+2NADPH+6NAD+→C5H8+4CO2+6NADH+2NADP++H2O+4[H+]从方程式来看，1.5分子葡萄糖合成1分子异戊二烯的过程中消耗2分子NADPH，并生成6分子NADH，整个反应中的氧化还原型辅酶的代谢是不平衡。为了满足生物合成中对还原力NADPH的需求，杰能科公司过表达磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)提高磷酸戊糖途径(PPP)的效率，促进NADPH的生成，从而提高了异戊二烯的产率[2]。然而，PPP途径代谢流增加会催化产生CO2，造成碳源的浪费，降低转化率。此外，Stephanie等人在含有MVA途径的重组大肠杆菌中过表达转氢酶PntAB，异戊二烯产量提高3-4倍[3]。这种方法中PntAB的作用是将细胞内高浓度的NADH转化为NADPH：NADH+NADP+→NADPH+NAD+因此，1.5分子葡萄糖合成1分子异戊二烯的过程中产生的6分子NADH在PntAB作用下转化为6分子NADPH，可以满足异戊二烯合成中对NADPH的需求，不需要额外消耗碳源产还原力，从而提高了异戊二烯产量。从理论上来看，该方法中6分子NADPH中2分子NADPH用于异戊二烯合成外还剩余4分子NADPH，这部分过剩的还原力除了供细胞内其他物质合成外将会从呼吸链损失掉，对于生物合成来说是一种能量的浪费。主要参考文献：[1]VickersCE,SabriS.Isoprene.AdvBiochemEngBiotechnol.2015,148:289–317.[2]BeckZQ,CervinMA,NielsenAT,etal.CompositionsandmethodsofPGLfortheincreasedproductionofisoprene:US,8455236B2.2013-06-04.[3]DoneskeS,CampbellP.Microorganismandprocessforisopreneproduction:WO2013119340A1.2013-08-15.技术实现要素：针对上述情况，本发明提供了一种新的方法来平衡异戊二烯生物合成反应中氧化还原型辅酶的代谢。该方法将异戊二烯和另一种重要的化工产品1,3-丙二醇进行了联产。1,3-丙二醇作为一种重要的化工产品，其最主要的用途是作为单体合成新型聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)，在合成纤维材料、聚酯膜、工程塑料和纺织服装材料领域的应用前景非常广泛。本发明在大肠杆菌中构建了异戊二烯和1,3-丙二醇联产途径，使基因工程菌在甘油和葡萄糖混合碳源发酵中利用葡萄糖合成异戊二烯，利用甘油合成1,3-丙二醇。其中，1,3-丙二醇的合成途径中醛还原酶yqhD基因的催化活性需要以NADPH作为辅酶，其代谢反应方程式如下：C3H8O3+NADPH+H+→C3H8O2+NADP++H2O在1,3-丙二醇单产途径中，对还原力NADPH的需求将使菌株消耗更多的碳源。构建异戊二烯和1,3-丙二醇联产途径，并过表达转氢酶pntAB基因，使用基因工程手段使联产菌株利用葡萄糖合成异戊二烯，利用甘油合成1,3-丙二醇。从而，基因工程菌株在葡萄糖和甘油混合碳源发酵中可以将异戊二烯合成途径中过剩的4分子NADPH用来满足1,3-丙二醇生物合成对还原力的需求，联产反应方程式为：1.5C6H12O6+4C3H8O3→C5H8+4C3H8O2+4CO2+5H2O异戊二烯和1,3-丙二醇的理论质量产率分别为25％和82.6％，该方法一方面可以实现基因工程菌细胞内氧化还原型辅因子的代谢平衡，优化微生物功能；另一方面为目标产物的合成提供了还原力，从而使生物转化效率得到提高，达到提高产物产率的目的。本发明提供的异戊二烯和1,3-丙二醇的联产工程菌，是在宿主菌基因组上整合甘油脱水酶基因和甘油脱水酶再激活酶基因、敲除了甘油激酶基因，并过表达了乙酰辅酶A酰基转移酶/HMG-CoA还原酶基因、HMG-CoA合成酶基因、甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因、异戊二烯合成酶基因、醛还原酶基因和转氢酶基因而得，重组后的基因工程菌株可以利用葡萄糖和甘油混合碳源联产异戊二烯和1,3-丙二醇。所述宿主菌为大肠杆菌。所述甘油脱水酶基因(dhaB123)来源于肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae(dhaB1GenbankID：7947197；dhaB2GenbankID：7947198；dhaB3GenbankID：7947200)和甘油脱水酶再激活酶基因(gdrAB)来源于肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae(gdrAGenbankID：6936977；gdrBGenbankID：6938011)；乙酰辅酶A酰基转移酶/HMG-CoA还原酶基因(mvaE)来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，GenBankNo：AAG02438；HMG-CoA合成酶基因(mvaS)来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，GenBankNo：AAG02439；甲羟戊酸激酶基因ERG12(GenbankID：855248)、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8(GenbankID：855260)、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因ERG19(GenbankID：100195467)、异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1(GenbankID：855986)均来源于酿酒酵母Saccharomycescerevisiae；异戊二烯合成酶基因(ispS4)来源于银白杨Populusalba，GenbankNo：AB198180；转氢酶基因(pntAB)来源于大肠杆菌Escherichiacoli，(pntA，GenbankNo：946628；pntB，GenbankNo：946144)；醛还原酶基因(yqhD)来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)，GenbankNo.947493；甘油激酶基因(glpK)来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)，GenbankNo.948423。本发明还提供一种联产异戊二烯和1,3-丙二醇的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：(1)宿主菌基因的整合：将甘油脱水酶基因dhaB和甘油脱水酶再激活酶基因gdrAB整合到宿主菌基因组上，获得基因整合宿主菌。(2)宿主菌的基因敲除：将步骤1)所得的基因整合宿主菌的甘油激酶基因glpK敲除，获得重组宿主菌。(3)重组质粒的构建：将乙酰辅酶A酰基转移酶基因/HMG-CoA还原酶基因、HMG-CoA合成酶基因、异戊二烯合成酶基因、醛还原酶基因和转氢酶基因克隆到质粒PACYCDuet-1，构建重组质粒PACY-mvaE-mvaS-ispS4-yqhD-pntAB(重组质粒1)。(4)重组质粒的构建：将甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因和异戊烯焦磷酸异构酶基因克隆到质粒pTrcHis2B得到重组质粒pTrc-low(重组质粒2)。(5)将步骤(3)所得的重组质粒PACY-mvaE-mvaS-ispS4-yqhD-pntAB和步骤(4)所得的重组质粒pTrc-low转化步骤(2)所得的重组宿主菌中，获得联产异戊二烯和1,3-丙二醇的基因工程菌。本发明所述基因工程菌宿主优选大肠杆菌。所述甘油脱水酶基因来源于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)的dhaB基因；所述甘油脱水酶再激活酶基因来源于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)的gdrAB基因；所述甘油激酶基因来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的glpK基因；所述乙酰辅酶A酰基转移酶/HMG-CoA还原酶基因来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的mvaE基因。所述HMG-CoA合成酶来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的mvaS基因。所述甲羟戊酸激酶来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的MVK基因。所述磷酸甲羟戊酸激酶来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的PMVK基因。所述焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的MVD基因。所述异戊烯焦磷酸异构酶来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的IDI1基因。所述异戊二烯合成酶来源于银白杨、黑杨、白杨或欧洲山羊，或其它植物，优选银白杨ispS4基因。所述醛还原酶基因来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的yqhD基因。所述转氢酶基因来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的pntAB基因。本发明还提供了一种将上述工程菌应用于联产异戊二烯和1,3-丙二醇的方法，是将活化后的基因工程菌接种到含有甘油和葡萄糖的发酵培养基中进行摇瓶培养或发酵罐发酵，联产异戊二烯和1,3-丙二醇。所述发酵培养基，碳源为质量体积比(g/ml)为1％～2％的葡萄糖和质量体积比(g/ml)为1％～2％的甘油。所述摇瓶培养是将基因工程菌接种于发酵培养基中37℃培养，摇床转速设为220rpm，OD600nm为0.6～0.8时加终浓度为0.5mM～1mM的IPTG和5μM～10μM的VB12，盖上密封塞，于30℃，220rpm条件下诱导表达48～60h。所述发酵罐发酵，是基因工程菌种子液按照体积比1％～1.5％接种量接种含有2L发酵培养基的5L发酵罐，以20～30g/L葡萄糖为底糖，于37℃，pH7.0，初始转速400rpm培养至OD600为15～20之间，加入0.5mM～1mM的IPTG和5μM～10μM的VB12，并开始流加甘油和葡萄糖两个碳源，诱导温度为30℃，发酵过程中始终维持残留葡萄糖浓度在1g/L以下，根据残留量来调控流加的速率，保证残留浓度不超过1g/L，甘油恒速流加，溶氧控制在5％～10％(溶氧电极测定值)，发酵时间为48～60h。相比于已报道的为生物合成途径提供还原力的方法，本发明具有如下优势：(1)本发明提供的异戊二烯和1,3-丙二醇联产菌株和联产方法是将还原力过剩的MVA途径与还原力不足的1,3-丙二醇合成途径进行联产，不仅使异戊二烯MVA途径产生的还原力得到充分的利用，还可以减少1,3-丙二醇合成中由于还原力的需求而对碳源的过多消耗，既平衡了细胞内的氧化还原型辅因子的代谢，又提高了目标产物的产率。(2)由于该策略实现了的氧化还原型辅因子的代谢平衡，反应中也不需要氧气，因此具有微氧发酵或厌氧发酵的潜力。(3)该方法将两种重要的化工产品异戊二烯和1,3-丙二醇进行联产，异戊二烯以气体形式产出，而1,3-丙二醇可以从发酵液中获得，不需要对两种产物进行分离，这对工业生产降低联产成本具有重要意义。目前，利用基因工程手段构建异戊二烯和1,3-丙二醇的联产菌株，并过表达转氢酶PntAB来调控细胞内氧化还原型辅因子代谢平衡并提高目标产物产率的策略还未有报道。本发明取得的有益效果如下：(1)本发明首次在宿主大肠杆菌基因组上整合了甘油脱水酶基因dhaB和甘油脱水酶再激活酶基因gdrAB并敲除甘油激酶glpK基因的基础上，表达了异戊二烯MVA途径和1,3-丙二醇合成途径，实现了甘油和葡萄糖混合碳源发酵条件下的异戊二烯和1,3-丙二醇的联产。而没有敲除glpK的对照菌虽然也含有完整的异戊二烯MVA途径和1,3-丙二醇合成途径，但在甘油和葡萄糖混合碳源发酵下只产生异戊二烯而不产生1,3-丙二醇，说明本专利中glpK基因敲除策略对联产的重要性。(2)在相同的发酵培养条件下，未过表达pntAB的联产菌株与单产对照菌株相比，异戊二烯和1,3-丙二醇产率分别提高1.5倍和7.6倍。(3)在葡萄糖和甘油混合碳源培养下，过表达pntAB基因的联产工程菌株异戊二烯和1,3-丙二醇的质量产率分别为21.2％和78％，达到理论质量产率的85％和94.4％(异戊二烯理论质量产率为25％，1,3-丙二醇的理论质量产率为82.6％)，总质量产率为52％，达到理论总质量产率(58.3％)的89.2％。相比于没有过表达pntAB基因的对照菌株，异戊二烯和1,3-丙二醇产率分别提高了2倍和2.6倍，总产率提高2.4倍。定义和缩写在本文中使用下列的缩写或简称：甲羟戊酸：MVA1,3-丙二醇：1,3-PDO异丙基硫代半乳糖苷：IPTG醛还原酶基因：yqhD转氢酶基因：pntAB甘油脱水酶基因：dhaB甘油脱水酶再激活酶基因：gdrAB乙酰辅酶A酰基转移酶/HMG-CoA还原酶基因：mvaEHMG-CoA合成酶基因：mvaS异戊二烯合成酶基因：ispS4甲羟戊酸激酶基因：mvk磷酸甲羟戊酸激酶基因：pmvk焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因：mvd异戊烯焦磷酸：IPPIPP异构酶基因：IDI1大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)：E.coli“过量表达”或“过表达”指细胞内特定基因受到各种信号调控后，在生物体中超过原有水平表达，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。附图说明图1重组大肠杆菌利用葡萄糖和甘油发酵生产异戊二烯和1,3-丙二醇的代谢途径。图2PACY-yqhD重组质粒图谱。图3PACY-mvaE-mvaS-ispS4-yqhD-pntAB重组质粒图谱。图4glpK基因敲除对工程菌株利用混合碳源联产异戊二烯和1,3-丙二醇的影响图5异戊二烯标准品的气相色谱图图6基因工程菌G02在葡萄糖和甘油混合碳源摇瓶发酵下产物的气相色谱图图71,3-丙二醇标准品的高效液相色谱图图8基因工程菌G02在葡萄糖和甘油混合碳源摇瓶发酵下产物的高效液相色谱图图9过表达转氢酶pntAB基因对联产菌株在混合碳源摇瓶培养下产物质量产率的影响图10过表达转氢酶pntAB基因对联产菌株在混合碳源发酵罐水平发酵产物质量产率的影响具体实施方式下面通过实例来详细阐明本发明。但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中所涉及的实验方法若无特殊说明，均为常规技术。下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。所用限制性内切酶及T4DNA连接酶均购自MBIFermentas公司，质粒提取及胶回收所用试剂盒购自美国OMEGA公司，操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。实施例1基因工程菌的构建通过在基因组上整合了甘油脱水酶基因和甘油脱水酶再激活酶基因，并敲除了甘油激酶基因的大肠杆菌体内过表达乙酰辅酶A酰基转移酶/HMG-CoA还原酶基因、HMG-CoA合成酶基因、甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因、异戊二烯合成酶基因、醛还原酶基因和转氢酶基因，得到的基因工程菌可以利用葡萄糖和甘油混合碳源发酵联产异戊二烯和1,3-丙二醇，同时实现细胞内NADPH的再生。联产菌株代谢途径和辅因子改造方法如图1所示。1.基因整合1.1将甘油脱水酶基因dhaB和甘油脱水酶再激活酶基因gdrAB整合到大肠杆菌基因组DNA甘油脱水酶基因(dhaB123)(dhaB1GenbankID：7947197；dhaB2GenbankID：7947198；dhaB3GenbankID：7947200)和甘油脱水酶再激活酶基因(gdrAB)(gdrAGenbankID：6936977；gdrBGenbankID：6938011)克隆后，通过基因整合技术使dhaB和gdrAB整合到大肠杆菌基因组中，获得重组大肠杆菌1463。此步骤参见GaoYQ，etal.DevelopmentofGeneticallyStableEscherichiacoliStrainsforPoly(3-Hydroxypropionate)Production.PLoSOne.2014,9(5):e97845.1.2将1.1中基因整合的大肠杆菌甘油激酶基因glpK敲除采用DNA同源重组技术将1.1中重组大肠杆菌1463的甘油激酶基因(glpK，GeneID:948423)敲除，获得重组宿主大肠杆菌。具体方法为：1.2.1PCR扩增glpK同源臂up和downglpK同源臂up和down的PCR扩增体系：以大肠杆菌w3110基因组DNA为PCR扩增模板，以up-F和up-R为引物扩增up片段，PCR体系为下述PCR体系1，以down-F和down-R为引物扩增down片段，PCR体系为下述PCR体系2，引物序列如下：up-F:5’-TCCCCCCGGGTCAGATCAATGGTGCCTTTGGC-3’；up-R:5’-GGCGGTTGGCTTCTGGCAGAAC-3’；down-F:5’-GAGGTTCTGCCAGAAGCCAACCGCCTGGAGCTTTGGGTGGCCCAGAT-3’；down-R:5’-CTAGTCTAGAAGCAGACTCATCACATTGTTCGCGG-3’。使用Takara公司的PrimerSTARMaxDNAPolymerase，货号为R045Q(PCR体系1,2中用PrimeSTARMAX表示)。PCR反应条件均设置如下：98℃3min；98℃15sec，55℃10sec，72℃1min,30个循环；72℃10min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，用切胶回收试剂盒(OMEGA，D2500-2)分别回收目的片段up和down，up和down均为700bp长度。1.2.2PCR搭桥连接同源臂OverlapPCR体系：以up和down基因片段为模板，up-F和down-R为引物，将up与down进行搭桥PCR，得到ΔglpK。使用Takara公司的PrimerSTARMaxDNAPolymerase，货号为R045Q(在以下PCR体系中用PrimeSTARMAX表示)。50μLPCR反应体系如下：PCR反应条件设置如下：98℃3min；98℃15sec，55℃10sec,72℃1min,30个循环；72℃10min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，用切胶回收试剂盒(OMEGA，D2500-2)回收目的片段ΔglpK，长度为1.4kb。1.2.3pre112-ΔglpK质粒的构建将pre112质粒和ΔglpK用XmaI和XbaI双酶切，用Cycle-Pure试剂盒(OMEGA，D2500-2)回收双酶切后的pre112和ΔglpK，将回收得到的ΔglpK基因片段与pre112载体按照摩尔比1:1的比例在T4连接酶的作用下16℃过夜酶连，将酶连产物42℃热激转化E.colicc118感受态细胞，以pre112-cm:5’-CAAGGCGACAAGGTGCTGATG-3’和up-F为引物对转化平板上的菌落进行PCR验证，阳性结果提取质粒进行XmaI和XbaI双酶切验证，确认阳性结果为重组质粒pre112-ΔglpK。1.2.4E.coliχ7213/pre112-ΔglpK质粒供体菌的构建取5μlpre112-ΔglpK质粒加入到100μl的E.coliχ7213感受态细胞中，冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2min，加入400μl无菌LB和30μl质量体积浓度(g/ml)为1％的DAP，37℃，180rpm，培养1h，7000rpm离心1min后弃去大部分上清，重悬菌体后取60μl涂布于表面涂布50μl质量体积浓度(g/ml)为1％的DAP溶液的Cm抗性平板，得到E.coliχ7213/pre112-ΔglpK质粒供体菌。1.2.5接合转移将步骤1.2.4所得的E.coliχ7213/pre112-ΔglpK接种于5mlLB液体培养基，加入5μLCM和50μL质量体积浓度(g/ml)为1％的DAP，37℃，摇床过夜培养。将步骤1.1中所得的重组菌1463接种于5mlLB液体培养基，37℃，摇床过夜培养。分别取过夜培养的供体菌E.coliχ7213/pre112-ΔglpK和受体菌1463各1ml菌液，6500×g离心2min，弃上清；用1mlddH2O清洗沉淀两遍，离心弃上清；加500μLddH2O重悬沉淀，各取100μL悬浊液，混匀后，离心弃上清；加50μL的质量体积浓度(g/ml)为1％的DAP重悬沉淀后，滴入无抗性平板，涂布，37℃培养12h以上；用1mlddH2O将长出的菌体洗下，吸至1.5ml无菌离心管，离心后用1mlddH2O洗一次，再用1mlddH2O重悬备用；将洗下的菌液稀释至10-1～10-4倍；各取30μL，涂布于Cm抗性平板，37℃，过夜培养。PCR验证单克隆菌落(引物1:up-F；引物2:glpK-3’:5’-GTGGCTGTTTGCCTGTTTCG-3’)，标记阳性菌，同时以未进行基因敲除的1463菌株为模板作对照，阳性菌株的PCR产物比1463菌株PCR产物的条带小约1300bp，根据条带大小的差别可将第一次重组的菌选出。将一次重组的阳性菌在新的Cm抗性LB平板上划线，37℃培养12h以上；挑取单克隆，接种于5ml无抗性的LB试管中，37℃培养12h以上，按照1：1000转接一次。稀释菌液至10-1～10-6倍，各倍数均取30μL涂布于含有质量体积浓度(g/ml)为10％的蔗糖固体平板培养基上，37℃培养12h以上；挑单克隆40个左右，一一对应划两种筛选平板(Cm抗性平板、10％蔗糖(g/ml)平板)，两个平板的同一划线处做相同编号后，37℃培养10h以上；选取10％蔗糖(g/ml)平板上生长，而Cm抗性平板上未生长的菌落做PCR菌落验证((引物1:up-F；引物2:glpK-3’:5’-GTGGCTGTTTGCCTGTTTCG-3’，PCR阳性结果为1.6kb片段)，正确的结果重新划线于蔗糖平板，37℃培养12h以上后挑单克隆再划线于蔗糖平板，37℃培养12h以上，以确保二次重组菌纯净。PCR验证正确的菌株接种到含有氯霉素的LB试管中，若菌株不生长，则获得阳性重组菌2632。2.表达载体的构建2.1PACY-mvaE-mvaS-ispS4-yqhD重组质粒和PACY-yqhD重组质粒的构建将来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的乙酰辅酶A酰基转移酶/HMG-CoA还原酶基因(mvaE，GenbankNo：AAG02438)、HMG-CoA合成酶基因(mvaS,GenbankNo：AAG02439)和来源于银白杨的异戊二烯合成酶基因(ispS4，GenbankNo：AB198180)克隆到PACYCDuet-1载体上，获得PACY-mvaE-mvaS-ispS4重组质粒，此步骤已经实现，具体参见YangJ,etal.EnhancingProductionofBio-IsopreneUsingHybridMVAPathwayandIsopreneSynthaseinE.coli.PLoSOne.2012,7(4):e33509.在此基础上，将yqhD基因克隆到PACY-mvaE-mvaS-ispS4质粒上，具体步骤如下：2.1.1外源基因yqhD的克隆醛基还原酶基因yqhD的PCR体系：以大肠杆菌w3110基因组DNA为模板，引物为yqhD-F：5’-ATCGCGATCGCCCAGCAAAGGGAGCAAGTAATG-3’和yqhD-R：5’-CCGCTCGAGTTAGCGGGCGGCTTCGTATATAC-3’，使用Takara公司的PrimerSTARMaxDNAPolymerase，货号为R045Q(在以下PCR体系中用PrimeSTARMAX表示)。PCR扩增体系：PCR反应条件设置如下：98℃3min；98℃15sec，55℃10sec，72℃1min,30个循环；72℃10min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，用切胶回收试剂盒(OMEGA，D2500-2)回收目的片段yqhD，片段长度约1.1kb。2.1.2PACY-mvaE-mvaS-ispS4-yqhD重组质粒的构建将2.1.1中得到的yqhD基因和PACY-mvaE-mvaS-ispS4质粒用Fermentas公司的FastDigestpvuⅠ(货号FD0624)和FastDigestXhoⅠ(货号FD0694)双酶切，酶切体系为：将以上体系置于37℃维持1h后，用Cycle-Pure试剂盒(OMEGA，D6492-2)回收双酶切后的yqhD片段(约1.1kb)和PACY-mvaE-mvaS-ispS4载体(约9.2kb)，将片段与载体按照摩尔比1:1的比例在T4连接酶的作用下16℃过夜酶连，将酶连产物42℃热激转化DH5α感受态细胞，以yqhD-F和T7ter：5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’为引物对转化平板上的菌落进行PCR验证，阳性结果的电泳条带在1.3kb左右，从阳性结果提取质粒进行pvuⅠ和XhoⅠ双酶切验证，确认阳性结果为重组质粒PACY-mvaE-mvaS-ispS4-yqhD。2.1.3PACY-yqhD重组质粒的构建将2.1.1中得到的yqhD基因和PACYCDuet-1质粒(约4kb)用Fermentas公司的FastDigestpvuⅠ(货号FD0624)和FastDigestXhoⅠ(货号FD0694)双酶切，酶切体系为：将以上体系置于37℃维持1h后，酶切后片段和载体用cycle-purekit(OMEGA，D6492-02)回收后，将片段与载体按照摩尔比1:1的比例在T4连接酶的作用下16℃过夜酶连，将酶连产物42℃热激转化DH5α感受态细胞，以yqhD-F和T7ter为引物对转化平板上的菌落进行PCR验证(阳性结果约为1.3kb)，从阳性结果提取质粒进行pvuⅠ和XhoⅠ双酶切验证，切下约1.1kb的片段为阳性结果，即为PACY-yqhD重组质粒(质粒图谱如图2所示)2.2PACY-mvaE-mvaS-ispS4-yqhD-pntAB重组质粒的构建2.2.1外源基因pntAB的克隆pntAB基因片段的PCR扩增体系：以大肠杆菌w3110基因组DNA为模板，引物为pntAB-F:5’-GGAAGATCTAACCGATGGAAGGGAATATCATG-3’和pntAB-R:5’-ATCGCGATCGTTACAGAGCTTTCAGGATTGCATC-3’。体系同2.1.1，PCR反应条件设置如下：98℃3min；98℃15sec，55℃10sec，72℃1min,30个循环；72℃10min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，用切胶回收试剂盒(OMEGA，D2500-2)回收目的片段pntAB(约2.9kb)。2.2.2PACY-mvaE-mvaS-ispS4-yqhD-pntAB重组质粒的构建将2.2.1中得到的pntAB基因(约2.9kb)和2.1.2中得到的PACY-mvaE-mvaS-ispS4-yqhD质粒(约10.3kb)用Fermentas公司的FastDigestBglⅡ(货号FD0084)和FastDigestPvuⅠ(货号FD0624)双酶切，体系同2.1.3，基因和质粒酶切后的产物用cycle-purekit(OMEGA，D6492-02)回收后，将基因片段与质粒载体按照摩尔比1:1的比例在T4连接酶的作用下16℃过夜酶连，将酶连产物42℃热激转化DH5α感受态细胞，以pntAB-F和T7ter为引物对转化平板上的菌落进行PCR验证(PCR产物电泳条带约4.3kb为阳性)，阳性结果提取质粒进行BglⅡ和PvuⅠ双酶切验证，切下2.9kb片段的为阳性结果，即为重组质粒PACY-mvaE-mvaS-ispS4-yqhD-pntAB，质粒图谱如图3所示。2.3pTrc-low重组质粒的构建pTrc-low质粒是携带有来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的甲羟戊酸激酶基因(ERG12，GenBankNo：855248)，磷酸甲羟戊酸激酶基因(ERG8，GenBankNo：855260)，焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因(ERG19，GenBankNo：100195467)，异戊烯焦磷酸异构酶基因(IDI1，GenBankNo：855986)的pTrcHis2B。该质粒的构建方法参见YangJ,etal.EnhancingProductionofBio-IsopreneUsingHybridMVAPathwayandIsopreneSynthaseinE.coli.PLoSOne.2012,7(4):e33509.。3.表达载体转化宿主菌按照感受态制备试剂盒(TAKARA，D406)说明制备1463和2632的感受态细胞。将PACY-mvaE-mvaS-ispS4-yqhD和pTrc-low质粒通过热激转化宿主菌1463和2632的感受态细胞，得到基因工程菌G01和G02；将PACY-mvaE-mvaS-ispS4-yqhD-pntAB和pTrc-low质粒通过热激转化宿主菌2632的感受态细胞，得到基因工程菌G03；将PACY-yqhD质粒通过热激转化宿主菌1463的感受态细胞得到1,3-丙二醇单产工程菌G04。将PACY-mvaE-mvaS-ispS4和pTrc-low质粒通过热激转化宿主菌E.coliBL21(DE3)的感受态细胞，得到基因工程菌2369。本实施例中构建的重组菌株保存在中国科学院青岛生物能源与过程研究所中国科学院生物基材料重点实验室(表1)。表1本发明使用或构建的重组菌实施例2发酵生产异戊二烯和1,3-丙二醇1、种子培养基：酵母粉5g/L，NaCl10g/L，蛋白胨10g/L。G01、G02、G03和2369的培养需要加入氨苄青霉素100μg/mL和氯霉素34μg/mL，G04菌株培养时只加入氯霉素34μg/mL。2、发酵培养基：K2HPO4·3H2O9.8g/L，Citricacid·H2O2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，牛肉膏5g/L，1mol/LMgSO4·7H2O2ml/L，1mL1000×微量元素((NH4)6Mo7O24·4H2O3.7g/L；ZnSO4·7H2O2.9g/L；H3BO324.7g/L；CuSO4·5H2O2.5g/L；MnCl2·4H2O15.8g/L)，G01、G02、G03和2369的培养需要加入氨苄青霉素100μg/mL和氯霉素34μg/mL，G04菌株培养时只加入氯霉素34μg/mL。发酵培养基中碳源葡萄糖和甘油的添加按照培养要求分别添加质量体积浓度(g/mL)2％葡萄糖、2％甘油和1％甘油+1％葡萄糖。3、摇瓶培养：将工程菌株单克隆接种于5ml种子培养基，37℃，220rpm培养12～18小时。活化后的工程菌按照1:100的体积比接种于含有100ml发酵培养基的摇瓶中，37℃，220rpm培养至OD600为0.6～0.8时，向菌液中加入终浓度为0.5mM的IPTG和5μM的VB12，盖上密封塞，于30℃，220rpm条件下诱导表达48h。4、发酵罐发酵：将工程菌株单克隆接种于5ml种子培养基，37℃，220rpm培养12～18小时，得到一级种子液。将1ml一级种子转接于100ml种子培养基，37℃，220rpm培养12～18小时，得到二级种子液。将二级种子按照1:100的比例接种于装有2L发酵培养基的5L小型发酵罐中，底糖为20g/L～30g/L葡萄糖。通过添加氨水，保持pH为7.0，初始转速为400rpm，溶氧控制在5％～10％。培养温度为37℃，培养至OD600在15～20范围时，加入诱导剂IPTG和VB12至终浓度分别为0.5mM和5μM，30℃发酵48～60h，期间不断的流加葡萄糖和甘油，并维持残留葡萄糖和甘油浓度在1g/L以下。5、异戊二烯和1,3-丙二醇的检测异戊二烯浓度测定：气相色谱法工程菌株在摇瓶中诱导表达后，用密封塞封口，继续培养48～60h后，抽取1mL顶空气体进行气相色谱检测，以异戊二烯标准品作为标准。发酵罐诱导表达后每间隔半小时抽取1ml尾气进行气相色谱检测。气相色谱检测条件：GC系统采用山东鲁南瑞虹SP-6890型气相色谱仪，色谱柱为CP-Wax58(FFAP)CBcolumn(25m×250μm×0.2μm)，检测器为FID检测器；气化室温度50℃，柱室温度50℃(未经过升温程序)，检测器温度100℃。1,3-丙二醇和残糖(葡萄糖和甘油)浓度的测定：高效液相色谱HPLC法摇瓶培养结束时取发酵液于10000rpm离心5min后将上清液稀释一定倍数过0.22μm滤膜后，进行HPLC检测。发酵罐诱导表达后每隔4h取发酵液于10000rpm离心5min后将上清液稀释一定倍数，进行HPLC检测。HPLC检测条件：色谱柱Bio-RadAminexHPX-87HColumn,300×7.8mm；流动相：5mMH2SO4；洗脱条件为：流动相平衡60min，洗脱时间30min，流速为0.5mL/min；检测器：示差检测器。柱温：55℃。6、工程菌株摇瓶水平联产异戊二烯和1,3-丙二醇。将活化后的工程菌株按体积比1％接种量转接于含有质量体积浓度(g/mL)1％葡萄糖+1％甘油混合碳源的发酵培养基中，加入氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，氯霉素终浓度为34μg/mL，37℃、220rpm条件下培养至细胞OD600达到0.6-0.8之间，加入终浓度0.5mM的IPTG和5μM的VB12，30℃，220rpm，诱导表达48h。发酵结束后检测异戊二烯和1,3-丙二醇的产量。研究结果发现，含有完成MVA途径及1,3-丙二醇合成途径的工程菌株G01在混合碳源培养下可以消耗葡萄糖和甘油合成异戊二烯，但是不产生1,3-丙二醇(结果如图4)。而敲除了glpK基因的基因工程菌G02可以利用葡萄糖和甘油混合碳源联产269mg/L异戊二烯和429mg/L的1,3-丙二醇(异戊二烯标准品和样品的GC图谱见图5和图6，1,3-丙二醇标准品和样品的HPLC图谱见图7和图8)。该实施例说明，两个产物的代谢途径加和并不能联产异戊二烯和1,3-丙二醇，基因工程菌的glpK基因敲除是实现基因工程菌利用葡萄糖和甘油混合碳源联产异戊二烯和1,3-丙二醇的关键技术手段。7、联产菌株与单产菌株的发酵产物产率对比将G02和2369菌株分别接种于含有质量体积浓度为(g/mL)2％的葡萄糖唯一碳源的发酵培养基中，加入氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，氯霉素终浓度为34μg/mL，37℃、220rpm条件下培养至细胞OD600达到0.6-0.8之间，加入终浓度0.5mM的IPTG和5μM的VB12，30℃，220rpm诱导表达。48h后测定发酵产物异戊二烯和1,3-丙二醇的产量。结果发现，联产菌株G02异戊二烯的产率比异戊二烯单产菌株2369提高了1.5倍。在含有质量体积浓度(g/mL)2％甘油唯一碳源的发酵培养基中培养G02和G04菌株，联产菌株G02的1,3-丙二醇产率比1,3-丙二醇单产菌株G04提高7.6倍(结果见表2)。表2联产菌株G02和单产菌株的产物质量产率*对比菌株碳源**异戊二烯产率(％)碳源**1,3-丙二醇产率(％)G022％葡萄糖9.52％甘油67.2523692％葡萄糖6.22％甘油8.8*异戊二烯的质量产率是产生的异戊二烯(g)/消耗的葡萄糖(g)；1,3-丙二醇的质量产率是产生的1,3-丙二醇(g)/消耗的甘油。**质量体积浓度(g/ml)。8、联产菌株过表达pntAB对发酵产物产率的影响将联产菌株G02和G03分别接种于含有质量体积浓度(g/mL)1％的葡萄糖和1％的甘油的发酵培养基中培养，加入氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，氯霉素终浓度为34μg/mL，37℃、220rpm条件下培养至细胞OD600达到0.6-0.8之间，加入终浓度0.5mM的IPTG和5μM的VB12，30℃，220rpm诱导表达。48h后测定发酵产物异戊二烯和1,3-丙二醇的产率。结果发现，联产菌株G02过表达pntAB之后，异戊二烯和1,3-丙二醇的产率分别提高了2倍和2.3倍，总产率提高1.6倍(结果见图9)。可以推测，过表达pntAB使菌体细胞内氧化还原辅因子代谢得到调控，优化了细胞功能，同时NADPH得到再生，为生物合成提供了更多的还原力，从而提高目标产物的产率。已有专利US,8455236B2中采用过表达pgl基因来提高还原力的策略使异戊二烯质量产率达到14.5％，而本实施例提供一种构建联产途径并过表达pntAB基因的策略使异戊二烯质量产率达到18.6％。9、工程菌株在发酵罐批式发酵下联产异戊二烯和1,3-丙二醇将工程菌株G02和G03单克隆分别接种于5ml种子培养基，37℃，220rpm培养12～18h，得到一级种子液。将1ml一级种子转接于100ml种子培养基，37℃，220rpm培养12～18h，得到二级种子液。将二级种子按照1:100的比例接种于装有2L发酵培养基的5L小型发酵罐中，加入氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，氯霉素终浓度为34μg/mL，，底糖为20～30g/L葡萄糖。通过添加氨水，保持pH为7.0，初始转速为400rpm，溶氧控制在5％～10％。培养温度为37℃，培养至OD600在15～20范围时，加入诱导剂IPTG和VB12至终浓度分别为0.5mM和5μM，30℃发酵48～60h，培养过程中始终维持残留葡萄糖浓度在0.1～0.5g/L范围内，甘油残留量在1g/L以下。从诱导开始每隔半小时测定异戊二烯产量，每隔4h测定1,3-丙二醇产量和菌体生物量。结果：经过48h发酵罐批次发酵后，工程菌株G02异戊二烯和1,3-丙二醇的产率分别为11％和30％，总产率为22％。工程菌株G03异戊二烯和1,3-丙二醇的产率分别为21.2％和78％，达到理论产率的85％和94.4％，总产率为52％，达到理论总产率的89.2％(见图10)。结果说明，过表达pntAB基因的联产菌株G03菌株比对照菌株G02的异戊二烯和1,3-丙二醇产率分别提高了2倍和2.6倍，总产率提高2.4倍。当前第1页1 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