利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法与流程

本发明涉及一种胶原蛋白的提取方法。更具体地说，本发明涉及一种利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法。

背景技术：

胶原蛋白是动物组织中的一类结构蛋白，具有粘度大、溶解度低和变性温度低等特点。以上特点在一定程度上限制了它的应用。它的提取方法主要有酸提取法、碱提取法、酶提取法和热水提取法等。用酸碱提取时间长，试剂用量大，产生大量的有害废弃物，提取率低。酶提取法能够保持胶原蛋白结构的完整性，但是提取成本高，并且提取时间较长，提取率较低。热水提取法虽然成本很低，但是提取率也低。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种提取效率高，胶原蛋白溶解度好，原料利用价值和胶原蛋白利用率均较高的胶原蛋白超声辅助酸提方法。

为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法，包括以下步骤：

步骤一、取新鲜或冷冻的中华鳖裙边切碎后以料液比为1:10～30加入质量分数为1.0～3.0％的NaCl溶液，于20℃下搅拌6～12h，然后在5000～10000rpm下高速匀浆1～3min后，收集一次沉淀，以料液比为1:10～30加入0.3～0.6mol/L的Na₂CO₃溶液，于20℃下搅拌6～12h，然后在5000～10000rpm下高速匀浆1～3min后，收集二次沉淀，以料液比为1:20～30加入0.2～0.4mol/L的EDTA水溶液浸泡除杂，于20℃下搅拌6～12h，然后在5000～10000rpm下高速匀浆1～3min，收集三次沉淀，用蒸馏水反复洗涤，充分沥干后备用，再加入与质量分数为1.0～3.0％的NaCl溶液同量的质量分数为5～20％的异丙醇溶液，于20℃浸泡12～30h，然后在5000～10000rpm下高速匀浆1～3min，收集四次沉淀，然后用蒸馏水反复洗涤，充分沥干后备用；

步骤二、取步骤一中充分沥干后的四次沉淀，以料液比为1:10～30加入0.3～0.6mol/L的乙酸溶液，并置于超声反应器中进行间歇式超声提取，每超声第一预定时间后，间歇第二预定时间，如此反复，超声功率为50～300W，超声时间为50～70min，然后在1000～3000rmp下离心3～6min后取上清液，再向上清液中添加NaCl，直至盐浓度为0.9mol/L，静置盐析18～30h后过滤，蛋白沉淀用0.3～0.6mol/L的乙酸复溶后，依次对0.1mol/L的乙酸和蒸馏水透析，最后冷冻干燥得到样品；

其中，所述第一预定时间小于等于所述第二预定时间。

优选的是，所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中，所述第一预定时间为2s，所述第二预定时间为2～6s。

优选的是，所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中，所述步骤一中，新鲜或冷冻的中华鳖裙边与质量分数为2.0％的NaCl溶液的料液比为1:20，搅拌时间为9h。

优选的是，所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中，所述步骤一中，所述一次沉淀与0.5mol/L的Na₂CO₃溶液的料液比为1:20，搅拌时间为9h。

优选的是，所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中，所述步骤一中，所述二次沉淀与0.3mol/L的EDTA水溶液的料液为1:25，搅拌时间为10h。

优选的是，所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中，所述步骤一中，所述三次沉淀与质量分数为10％的异丙醇溶液的料液比为1:20，于20℃浸泡24h。

优选的是，所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中，所述步骤一中的搅拌均为连续磁力搅拌。

本发明至少包括以下有益效果：超声辅助酸提方法提取胶原蛋白具有操作简单、处理时间短、蛋白得率高及能耗较低等优点。该方法得到的中华鳖裙边胶原蛋白得率为19.8％(w/w)，蛋白纯度为59.6％(w/w)，和传统酸提法比较，蛋白提取率增加了48.5％(w/w)，纯度提高了19.3％(w/w)。与传统酸提法相比，超声辅助酸提极大地改善了胶原蛋白的溶解性，采用超声辅助提取后，胶原蛋白的溶解性提高了16.5％～22.7％。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明的方法和对比例的方法所得胶原蛋白的氮溶指数的对比图；

图2为本发明的超声时间固定时，超声功率和液料比对超声辅助酸性胶原蛋白提取的影响的响应面图；

图3为本发明的液料比固定时，超声功率和超声时间对超声辅助酸性胶原蛋白提取的影响的响应面图；

图4为本发明的超声功率固定时，料液比和超声时间对超声辅助酸性胶原蛋白提取的影响的响应面图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供一种利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法，包括以下步骤：

步骤一、取新鲜或冷冻的中华鳖裙边切碎后以料液比为1:10～30加入质量分数为1.0～3.0％的NaCl溶液，于20℃下搅拌6～12h，以去除水溶性和盐溶性蛋白。然后在5000～10000rpm下高速匀浆1～3min后，收集一次沉淀，以料液比为1:10～30加入0.3～0.6mol/L的Na₂CO₃溶液，于20℃下搅拌6～12h，以除去非胶原蛋白成分和色素。然后在5000～10000rpm下高速匀浆1～3min后，收集二次沉淀，以料液比为1:20～30加入0.2～0.4mol/L的EDTA水溶液浸泡除杂，以除去矿物质。于20℃下搅拌6～12h，然后在5000～10000rpm下高速匀浆1～3min，收集三次沉淀，用蒸馏水反复洗涤，充分沥干后备用。再加入与质量分数为1.0～3.0％的NaCl溶液同量的质量分数为5～20％的异丙醇溶液，于20℃浸泡12～30h，然后在5000～10000rpm下高速匀浆1～3min，收集四次沉淀，以除去脂肪，然后用蒸馏水反复洗涤，充分沥干后备用。

步骤二、取步骤一中充分沥干后的四次沉淀，以料液比为1:10～30加入0.3～0.6mol/L的乙酸溶液，并置于超声反应器中进行间歇式超声提取，每超声第一预定时间后，间歇第二预定时间，其中，所述第一预定时间小于等于所述第二预定时间，如此反复，超声功率为50～300W，超声时间为50～70min。分阶段进行超声提取，使得提取更加充分、均匀，同时缩短了超声提取的时间。然后在1000～3000rmp下离心3～6min后取上清液，再向上清液中添加NaCl，直至盐浓度为0.9mol/L，静置盐析18～30h后过滤，蛋白沉淀用0.3～0.6mol/L的乙酸复溶后，依次对0.1mol/L的乙酸和蒸馏水透析，最后冷冻干燥得到样品。通过透析进一步纯化以上步骤提取得到的酸性胶原蛋白。

所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中，所述第一预定时间为2s，所述第二预定时间为2～6s，以使超声波的能量充分释放到混合物中，且不引起过高的温度。且超声时间短，间歇时间长，以使得超声混合更加均匀，且混合物保持在一定的范围内。

所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中，所述步骤一中，新鲜或冷冻的中华鳖裙边与质量分数为2.0％的NaCl溶液的料液比为1:20，搅拌时间为9h。

所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中，所述步骤一中，所述一次沉淀与0.5mol/L的Na₂CO₃溶液的料液比为1:20，搅拌时间为9h。

所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中，所述步骤一中，所述二次沉淀与0.3mol/L的EDTA水溶液的料液比为1:25，搅拌时间为10h。

所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中，所述步骤一中，所述三次沉淀与质量分数为10％的异丙醇溶液的料液比为1:20，于20℃浸泡24h。

所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中，所述步骤一中的搅拌均为连续磁力搅拌。

对比例

一种胶原蛋白的酸提方法，包括以下步骤：

步骤一、取新鲜或冷冻的中华鳖裙边切碎后以料液比为1:20加入质量分数为2.0％的NaCl溶液，于20℃下连续磁力搅拌9h。然后在8000rpm下高速匀浆2min后，收集一次沉淀，以料液比为1:20加入0.5mol/L的Na₂CO₃溶液，于20℃下连续磁力搅拌9h。然后在8000rpm下高速匀浆2min后，收集二次沉淀，以料液比为1:25加入0.3mol/L的EDTA水溶液浸泡除杂。于20℃下连续磁力搅拌10h，然后在8000rpm下高速匀浆2min，收集三次沉淀，用蒸馏水反复洗涤，充分沥干后备用。再以料液比为1:20加入质量分数为10％的异丙醇溶液，于20℃浸泡24h，然后在8500rpm下高速匀浆2min，收集四次沉淀，然后用蒸馏水反复洗涤，充分沥干后备用。

步骤二、取步骤一中充分沥干后的四次沉淀，以料液比为1:20加入0.4mol/L的乙酸溶液，搅拌均匀。然后在2000rmp下离心5min后取上清液，再向上清液中添加NaCl，直至盐浓度为0.9mol/L，静置盐析24h后过滤，蛋白沉淀用0.4mol/L的乙酸复溶后，依次对0.1mol/L的乙酸和蒸馏水透析，最后冷冻干燥得到样品。

实施例1

一种利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法，包括以下步骤：

步骤一、取新鲜或冷冻的中华鳖裙边切碎后以料液比为1:20加入质量分数为2.0％的NaCl溶液，于20℃下搅拌9h。然后在8000rpm下高速匀浆2min后，收集一次沉淀，以料液比为1:20加入0.5mol/L的Na₂CO₃溶液，于20℃下搅拌9h。然后在8000rpm下高速匀浆2min后，收集二次沉淀，以料液比为1:25加入0.3mol/L的EDTA水溶液浸泡除杂。于20℃下搅拌10h，然后在8000rpm下高速匀浆2min，收集三次沉淀，用蒸馏水反复洗涤，充分沥干后备用。再以料液比为1:20加入质量分数为10％的异丙醇溶液，于20℃浸泡24h，然后在8500rpm下高速匀浆2min，收集四次沉淀，以除去脂肪，然后用蒸馏水反复洗涤，充分沥干后备用。

步骤二、取步骤一中充分沥干后的四次沉淀，以料液比为1:20加入0.4mol/L的乙酸溶液，并置于超声反应器中进行间歇式超声提取，每超声2s后，间歇4s，如此反复，超声功率为200W，超声时间为60min。然后在2000rmp下离心5min后取上清液，再向上清液中添加NaCl，直至盐浓度为0.9mol/L，静置盐析24h后过滤，蛋白沉淀用0.4mol/L的乙酸复溶后，依次对0.1mol/L的乙酸和蒸馏水透析，最后冷冻干燥得到样品。

响应面是特定的响应值与对应的因素构成的三维空间，映射在二维平面上形成等高线，可直观地反映各因素的交互作用以及对响应值的影响。响应面曲面的坡度可反映该因素对蛋白质提取率影响的强弱程度。响应曲面相对平缓，说明其可容忍处理条件的影响。等高线图的形状表明变量间的交互作用是否显著，椭圆等高线表明变量间的交互作用显著，圆形等高线表明交互作用不显著。响应面曲线较陡，说明该提取参数对响应值的作用越显著，反之，某提取参数对响应值的作用较小，表现为曲线平缓。

当超声时间固定在水平0时，超声功率和液料比对超声辅助酸性胶原蛋白提取的影响见响应面图1，超声功率和液料比对超声辅助酸性胶原蛋白提取得率呈二次方效应，当液料比较低时，提高超声功率，超声辅助酸性胶原蛋白的得率先升高后下降。图2是固定液料比为20:1mL/g时，超声功率和超声时间对超声辅助酸性胶原蛋白提取的影响，超声功率和超声时间对超声辅助酸性胶原蛋白提取得率也呈二次方效应，超声功率和超声时间对应的曲面比较陡峭，说明这两个因素相对结果影响显著，这与方差分析的结果一致。图3是固定超声功率为200W时，料液比和超声时间对超声辅助酸性胶原蛋白提取的影响，提取率随着液料比及超声时间的增加先升高，但增加幅度不明显。

羟脯氨酸标准曲线的绘制

精确称取羟脯氨酸100mg，用0.001mol/L的盐酸溶解，配制成1mg/mL的羟脯氨酸储备液，取1mL储备液稀释至100mL配制成10μg/mL的标准溶液。配制1mg以0.001mol/L的盐酸作为空白液，在羟脯氨酸标准溶液和空白液中分别加入氯胺T溶液2mL，混匀，室温下静置20min，加入高氯酸溶液2mL，混匀，室温下静置5min，加入对甲基氨基苯甲酸2mL，混匀，60℃加热20min进行显色反应，最后置于冷水中冷却。以空白液调零，测定560nm处的吸光度，绘制标准曲线。

样品中羟脯氨酸含量的测定

取实施例1中的待测样品约10mg于安瓿瓶中，加入1mL 6mol/L的盐酸，用酒精喷灯封口后于130℃下水解3h，取出用蒸馏水定容至10mL，滤纸过滤，取1mL按羟脯氨酸标准曲线的测定方法，以空白调零，测定待测样品的吸光度。由羟脯氨酸标准曲线换算出样品液中羟脯氨酸的浓度。

溶解性(氮溶指数NSI)的测定

将实施例1中的胶原蛋白样品0.4000g均匀分散于20mL蒸馏水中，室温下放置30min，用0.1mol/L的HCL溶液或0.1mol/L NaOH溶液调节溶液的pH值，用均质机在13400rpm下均质1min，定容至25mL，分散液以4000rpm的速度离心15min，取上清液及胶原蛋白样品用凯氏定氮法测含氮量，公式如下：

NSI(％)＝(上清液中的含氮量/样品中总氮量)×100

如图1所示，位于上方的曲线表示利用本发明的超声辅助酸提胶原蛋白的氮溶指数随pH的变化，位于下方的曲线表示常规酸提胶原蛋白的氮溶指数随pH的变化，可以看出，超声辅助酸提方法提取胶原蛋白具有操作简单、处理时间短、蛋白得率高及能耗较低等优点。该方法得到的中华鳖裙边胶原蛋白得率为19.8％(w/w)，蛋白纯度为59.6％(w/w)，和传统酸提法比较，蛋白提取率增加了48.5％(w/w)，纯度提高了19.3％(w/w)。与传统酸提法相比，超声辅助酸提极大地改善了胶原蛋白的溶解性，采用超声辅助提取后，胶原蛋白的溶解性提高了16.5％～22.7％。

实施例2

一种利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法，包括以下步骤：

步骤一、取新鲜或冷冻的中华鳖裙边切碎后以料液比为1:10加入质量分数为1.0％的NaCl溶液，于20℃下搅拌6h。然后在5000rpm下高速匀浆1min后，收集一次沉淀，以料液比为1:10加入0.3mol/L的Na₂CO₃溶液，于20℃下搅拌6h。然后在5000rpm下高速匀浆1min后，收集二次沉淀，以料液比为1:20加入0.2mol/L的EDTA水溶液浸泡除杂。于20℃下搅拌6h，然后在5000rpm下高速匀浆1min，收集三次沉淀，用蒸馏水反复洗涤，充分沥干后备用。再以料液比为1:10加入质量分数为5％的异丙醇溶液，于20℃浸泡12h，然后在5000rpm下高速匀浆1min，收集四次沉淀，然后用蒸馏水反复洗涤，充分沥干后备用。

步骤二、取步骤一中充分沥干后的四次沉淀，以料液比为1:10加入0.3mol/L的乙酸溶液，并置于超声反应器中进行间歇式超声提取，每超声2s后，间歇2s，如此反复，超声功率为50W，超声时间为50min。然后在1000rmp下离心3min后取上清液，再向上清液中添加NaCl，直至盐浓度为0.9mol/L，静置盐析18h后过滤，蛋白沉淀用0.3mol/L的乙酸复溶后，依次对0.1mol/L的乙酸和蒸馏水透析，最后冷冻干燥得到样品。

实施例3

一种利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法，包括以下步骤：

步骤一、取新鲜或冷冻的中华鳖裙边切碎后以料液比为1:30加入质量分数为3.0％的NaCl溶液，于20℃下搅拌2h。然后在10000rpm下高速匀浆3min后，收集一次沉淀，以料液比为1:30加入0.6mol/L的Na₂CO₃溶液，于20℃下搅拌12h。然后在10000rpm下高速匀浆3min后，收集二次沉淀，以料液比为1:30加入0.4mol/L的EDTA水溶液浸泡除杂。于20℃下搅拌12h，然后在10000rpm下高速匀浆3min，收集三次沉淀，用蒸馏水反复洗涤，充分沥干后备用。再以料液比为1:30加入质量分数为20％的异丙醇溶液，于20℃浸泡30h，然后在10000rpm下高速匀浆3min，收集四次沉淀，然后用蒸馏水反复洗涤，充分沥干后备用。

步骤二、取步骤一中充分沥干后的四次沉淀，以料液比为1:30加入0.6mol/L的乙酸溶液，并置于超声反应器中进行间歇式超声提取，每超声2s，间歇6s，如此反复，超声功率为300W，超声时间为70min。然后在3000rmp下离心6min后取上清液，再向上清液中添加NaCl，直至盐浓度为0.9mol/L，静置盐析30h后过滤，蛋白沉淀用0.6mol/L的乙酸复溶后，依次对0.1mol/L的乙酸和蒸馏水透析，最后冷冻干燥得到样品。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。