本发明涉及生物医学领域。具体地，本发明涉及DKK1自身抗体识别的抗原多肽及其用途。更具体地，本发明涉及DKK1自身抗体识别的抗原多肽、该多肽在制备检测肿瘤血清中DKK1抗体的用途、用于检测样品中DKK1抗体的试剂盒。
背景技术：
：肺癌是当今世界上对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居各类恶性肿瘤的首位。统计数据显示，肺癌的总5年生存率仅10％-15％，而I期患者的5年生存率可达65％-75％。目前寻找肿瘤相关标志物已成为肺癌早期诊断和免疫治疗的研究热点。但现阶段，应用于临床的肿瘤标志物仍然较少，且对肺癌的早期发现仍缺乏足够的敏感性、特异性。因此，目前迫切需要寻找有效肿瘤相关标志物用于肺癌早期诊断和预后检测。近年研究发现，肺癌患者循环中存在针对肿瘤相关抗原产生的自身抗体，甚至在肺癌临床症状出现5年前就可以被检测到，并且可能影响疾病进展，因此自身抗体可能成为肿瘤发生的早期标志物。相较于血清中肿瘤抗原型标志物，血清中肿瘤抗原相应自身抗体同时具有丰度高，易检测等优势，可能成为更为可靠的血清肿瘤标志物，将有助于肿瘤的早期诊断。因此，寻找肺癌抗原相应自身抗体，对于肺癌早期诊断以及预后检测意义重大。然而，目前相关报道很少。技术实现要素：首先，需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：目前利用ELISA等免疫印迹杂交技术检测血清自身抗体的方法均以纯蛋白作为识别抗原。由于多数蛋白存在翻译后修饰，使得体外表达的蛋白稳定性较差，且难以复性至天然构象，影响检测结果的稳定性。并且，纯化蛋白制备过程复杂，耗时长，成本较高。换言之，目前对自身抗体的检测主要局限于使用肿瘤相关抗原的重组蛋白，其制备过程繁琐，耗时长，诊断敏感性或特异性较低。本发明旨在解决现有技术的上述缺陷至少之一，而提供一种有用的商业选择。已知Dickkopf-1(DKK1)蛋白可作为肝癌早查早诊血清标志物，进而，本发明利用多肽微阵列的技术筛选获得了DKK1蛋白抗原识别高频表位，并提供了包含血清抗体识别DKK1蛋白的核心氨基酸序列的四种多肽序列(即DKK1自身抗体识别的抗原多肽)，它们可以根据识别不同的抗原表位，将人抗DKK1－IgG抗体分为不同亚型(DKK1蛋白上有多个抗原表位，每种血清抗体只识别其中一个抗原表位，血液中所有的抗DKK1抗体是一个多克隆集合，因此，根据所识别的抗原表位不同，可分为不同亚型)。基于非小细胞肺癌患者血清中DKK1抗体表达水平较健康人显著升高，利用本发明的DKK1自身抗体识别的抗原多肽，通过免疫印迹检测手段，可有效检测样品血清中不同亚型DKK1自身抗体水平，进而能够有效进行非小细胞肺癌诊断和预后风险评估。为此，在本发明的第一方面，本发明提供了一种DKK1自身抗体识别的抗原多肽。根据本发明的实施例，其多肽活性片段为下列至少之一：1)SEQIDNO:1所示序列：LYPGGNKYQTIDNYQPYP；2)SEQIDNO:2所示序列：LNSNAIKNLPPPLGGAAG；3)SEQIDNO:3所示序列：HFRGEIEETITE；4)SEQIDNO:4所示序列：IQKDHHQASNSSRLH；5)选自SEQIDNO:1-4所示氨基酸序列的至少两种的连接产物；6)1)-5)所述的多肽活性片段经氨基酸残基的修饰、取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列。发明人惊奇地发现，利用本发明的上述DKK1自身抗体识别的抗原多肽，通过免疫印迹检测等手段可有效检测待测者血清中的DKK1抗体水平，进而基于待测者血清DKK1抗体表达水平是否较健康人显著升高，能够有效进行非小细胞肺癌诊断和预后风险评估。其中，非小细胞肺癌患者血清中DKK1抗体表达水平较健康人显著升高。进而，在本发明的第二方面，本发明还提出了前面所述的DKK1自身抗体识别的抗原多肽在制备检测血清中DKK1抗体水平的试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于肿瘤诊断和预后风险评估。根据本发明的一些具体示例，所述肿瘤为肺癌，优选为非小细胞肺癌。基于非小细胞肺癌患者血清中DKK1抗体表达水平较健康人显著升高，利用本发明的试剂盒中的DKK1自身抗体识别的抗原多肽，通过免疫印迹检测手段，可有效检测样品血清中不同亚型DKK1自身抗体的水平，进而能够有效进行非小细胞肺癌诊断和预后风险评估。为此，在本发明的第三方面，本发明还提出了一种用于检测样品中DKK1抗体水平的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：前面所述的DKK1自身抗体识别的抗原多肽。利用本发明的试剂盒，采用其中的DKK1自身抗体识别的抗原多肽，通过免疫印迹检测等手段可有效检测待测者血清中的DKK1抗体水平，进而基于待测者血清DKK1抗体表达水平是否较健康人显著升高，能够有效进行非小细胞肺癌诊断和预后风险评估。其中，非小细胞肺癌患者血清中DKK1抗体表达水平较健康人显著升高。具体地，根据本发明的实施例，所述DKK1自身抗体识别的抗原多肽以下列的至少一种形式提供：1)96孔板，所述96孔板的孔中包被所述DKK1自身抗体识别的抗原多肽；2)微球，所述微球偶联所述DKK1自身抗体识别的抗原多肽。需要说明的是，根据实际实验需要，采用DKK1自身抗体识别的抗原多肽检测待测者血清中的DKK1抗体水平时，可以采用已知DKK1抗体作为标准品，这样可以简化实验步骤，精确实验结果。因而，根据本发明的一些实施例，该试剂盒进一步包括：标准品，所述标准品为DKK1抗体。由此，利用该试剂盒进行DKK1抗体水平检测和肿瘤诊断、预后风险评估时，结果更加可靠。根据本发明的一些具体示例，该试剂盒进一步包括：阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为已知DKK1抗体表达为阳性的混合血清，所述阴性对照品为已知DKK1抗体表达为阴性的血清。由此，利用该试剂盒进行DKK1抗体水平检测和肿瘤诊断、预后风险评估时，结果更加可靠。此外，还可以直接采用市售DKK1抗体作为阳性对照品。因而，根据本发明的一些具体示例，所述阳性对照品为DKK1抗体。由此，检测方便，结果可靠。根据本发明的实施例，所述样品为血清。根据本发明的一些实施例，所述样品为疑似肿瘤患者或者肿瘤预后患者的血清。根据本发明的一些具体示例，所述肿瘤为肺癌，优选为非小细胞肺癌。根据本发明的实施例，该试剂盒可以进一步包括：适于进行ELISA检测的试剂。由此，可以通过ELISA检测方法，利用根据本发明的多肽对样品中的DKK1自身抗体进行检测，从而可以进一步提高利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的DKK1自身抗体的效率。根据本发明的实施例，所述多肽设置于96孔板中。由此，可以方便地高通量地进行检测。可以进一步提高利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的DKK1自身抗体的效率。根据本发明的实施例，所述样品为来自肺癌或疑似肺癌患者以及健康志愿者的血液样品。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1显示了实施例2的多肽芯片1显影结果；图2显示了实施例3中，各待测样本中的SEQ1-4抗体水平检测结果；图3显示了实施例3中，SEQIDNO:1-4所示的多肽单独使用及联合使用对各待测样本中SEQ1-4抗体水平的检测敏感性、特异性的分析结果；图4显示了实施例3中，SEQIDNO:1-4所示的多肽单独使用对各肺癌患者预后情况与DKK1抗体水平的关系的检测结果，具体为DKK1抗体不同表达水平的肺癌患者的三年总生存期和中位生存期之间的关系图。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。DKK1自身抗体识别的抗原多肽在本发明的第一方面，本发明提供了一种DKK1自身抗体识别的抗原多肽。根据本发明的实施例，其多肽活性片段为下列至少之一：1)SEQIDNO:1所示序列：LYPGGNKYQTIDNYQPYP；2)SEQIDNO:2所示序列：LNSNAIKNLPPPLGGAAG；3)SEQIDNO:3所示序列：HFRGEIEETITE；4)SEQIDNO:4所示序列：IQKDHHQASNSSRLH；5)选自SEQIDNO:1-4所示氨基酸序列的至少两种的连接产物；6)1)-5)所述的多肽活性片段经氨基酸残基的修饰、取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列。发明人惊奇地发现，利用本发明的上述DKK1自身抗体识别的抗原多肽，通过免疫印迹检测等手段可有效检测待测者血清中的DKK1抗体水平，进而基于待测者血清DKK1抗体表达水平是否较健康人显著升高，能够有效进行非小细胞肺癌诊断和预后风险评估。其中，非小细胞肺癌患者血清中DKK1抗体表达水平较健康人显著升高。此外，上述的本发明的DKK1自身抗体识别的抗原多肽，对非小细胞肺癌患者的生存预后具有风险评估作用：根据本发明的一些具体示例，利用本发明的DKK1自身抗体识别的抗原多肽，通过免疫印迹检测手段检测非小细胞肺癌患者血清中的DKK1抗体水平，结果发现，自身抗体表达较高的患者的三年总生存期显著高于表达较低的患者，自身抗体表达较高的患者的中位生存期为32个月，自身抗体表达较低的患者的中位生存期为17个月。也即，利用本发明的上述DKK1自身抗体识别的抗原多肽，通过免疫印迹检测等手段检测待测者血清中的DKK1抗体水平，进而基于待测者血清DKK1抗体表达升高水平的程度不同，能够有效进行非小细胞肺癌的预后风险评估。其中，本文中采用的表达方式“三年总生存期”是指病人从确诊到经治疗3年后的存活人数，“中位生存期”指该部分病人从确诊后的平均生存时间。目前一般用这两个概念进行比较，以预示病人从确诊后的生存情况，可作为疾病恶劣程度的评价标准。并且，根据本发明的实施例，本发明的上述抗原多肽其DKK1抗体识别特异性好，DKK1抗体水平检测效率高，且制备简单，成本低，易于进行工业化生产，利于大量推广应用。需要说明的是，上述多肽均来自于DKK1(UniprotKB：O94907)的全长氨基酸序列(从蛋白质公共资源数据库uniprot获得)。另外，在本文中所使用的术语“多肽”是指至少两个氨基酸通过肽键连接而得到的寡聚物，其中，多肽中所包含的氨基酸残基的数目并不受特别限制。当然，本领域技术人员可以理解的是，还可以对上述多肽进行化学修饰，以便增加多肽的抗原性，有助于多肽包被到ELISA板底。根据本发明的实施例，利用具有上述氨基酸序列的多肽，能够有效地检测样品，例如肺癌或疑似肺癌患者的血液样品(例如血清样品)中的DKK1自身抗体。发明人发现从DKK1完整序列得到的上述多肽可以作为DKK1的抗原表位，能够与血液样本中DKK1自身抗体特异性的反应，因而，可以有效地用于检测对象血液样本中的DKK1自身抗体，由此，可以有效地用于筛查肺癌疑似患者血清，为肺癌的诊断提供了一个新的检验指标。本领域技术人员可以理解的是，可以有效地通过常规合成方法，合成上述多肽，从而代替重组表达的生物合成方式。根据本发明的实施例，可以用上述多肽进行检测的样品的类型并不受特别限制。根据本发明的实施例，优选的样品为来自肺癌或疑似肺癌患者的血液样本。由此，可以利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样本中的DKK1自身抗体，由此可以确定患者是否患有恶性肿瘤，为恶性肿瘤检测提供辅助手段，或者提供恶性肿瘤例如肺癌的早期筛查。另外，还可以通过检测对象血液中DKK1自身抗体的存在，而对患者进行预后预测分析。利用本发明的多肽检测样品中DKK1自身抗体的方法并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以通过酶联免疫吸附试验(ELISA)法，借助本发明的多肽检测样品中的DKK1自身抗体。由此，可以进一步提高利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的DKK1自身抗体的效率。作为示例，可以采用下列方法利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的DKK1抗体：首先，用pH9.6的碳酸盐缓冲液(NaCO30.159g，NaHCO30.293g，加水至100ml，pH值为9.6)稀释多肽至1μg/ml，以100μl/孔的量加入到96孔酶标板的孔中，封板膜密封后4℃过夜。接下来，弃去孔中的液体，TBS-T洗涤缓冲液(含0.1％Tween-20的PBS-T溶液配制为NaCl8g，KCL0.2g，Na2HPO4·12H2O3.58g,KH2PO40.24g加去离子水至1000ml，pH7.4，再加入Tween-201ml)洗涤酶标板3次，每次3min。接着，向孔中添加5％脱脂牛奶封闭缓冲液(5％脱脂牛奶配制为NaCl0.8g，KCL0.02g，Na2HPO4·12H2O0.358g,KH2PO40.024g，加去离子水至100ml，pH7.4，再加入Tween-200.5ml，脱脂奶粉5g)，每孔300μl，封板膜密封后37℃孵育1h。接着，添加待测样品。用5％脱脂牛奶封闭缓冲液稀释待测血清，稀释比例为1:100。完全弃去孔中液体，每孔加血清稀释液100μl，每例血清样本2个复孔，每板设立2个阳性对照孔，加入已知DKK1抗体，每板设立2个空白对照孔，加入0.1％PBS-T洗涤缓冲液。封板膜密封后4℃过夜。弃去孔中液体，洗涤酶标板3次，每次3min。接着，进行第二抗体免疫反应。利用5％脱脂牛奶封闭缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG，稀释比例1:2000，每孔加100μl，封板膜密封后37℃孵育1h。弃去孔中液体，洗涤酶标板3次，每次3min。接着，加底物显色。按照常规ELISA试剂盒说明书(例如康为世纪TMB显色试剂盒)，加入显色底物，每孔加入100μl，室温避光条件下显色25min，每孔加入50μl2MH2SO4终止反应。接着，酶标仪450nm波长条件下测定光密度OD值。最后，基于所得的光密度OD值，再与预定参考值X的比较，确定待测样本是否来源于非小细胞肺癌患者。其中，X为健康人中非小细胞肺癌患者和健康人血清抗体相对浓度的受试者工作曲线(ROC曲线)最优点下的相对浓度。根据本发明的一些具体示例，X是发明人通过实验计算获得，具体方法为根据约登指数公式：约登指数＝敏感性+特异性-1，来计算约登指数，然后取约登指数最大值时所对应的光密度值为X。根据本发明实施例，采用206例非小细胞肺癌患者血清样本和99例健康人血清样本，计算得到SEQIDNO:1-4所示序列的X值依次为0.49、0.45、0.38和0.37。由此，如果待测样本中的识别抗体相对浓度高于X，则待测血清为疑似非小细胞肺癌患者血清。DKK1自身抗体识别的抗原多肽的应用及试剂盒由此，在本发明的第二方面，本发明还提出了前面所述的DKK1自身抗体识别的抗原多肽在制备检测血清中DKK1抗体水平的试剂盒中的用途。由此，可以利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的DKK1自身抗体，由此可以确定患者是否患有恶性肿瘤，为恶性肿瘤检测提供辅助手段，或者监控恶性肿瘤例如肺癌的进展。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于肿瘤诊断和预后风险评估。根据本发明的一些具体示例，所述肿瘤为肺癌，优选为非小细胞肺癌。基于自身抗体表达较高的患者的三年总生存期、中位生存期均显著高于表达较低的患者，利用本发明的试剂盒中的DKK1自身抗体识别的抗原多肽，通过免疫印迹检测等手段检测待测者血清中的DKK1抗体水平，进而基于待测者血清DKK1抗体表达升高水平的程度不同，能够有效进行非小细胞肺癌的预后风险评估。进而，在本发明的第三方面，本发明提出了一种用于检测样品中DKK1抗体水平的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：前面所述的DKK1自身抗体识别的抗原多肽。利用本发明的试剂盒，采用其中的DKK1自身抗体识别的抗原多肽，通过免疫印迹检测等手段可有效检测待测者血清中的DKK1抗体水平，进而基于待测者血清DKK1抗体表达水平是否较健康人显著升高，能够有效进行非小细胞肺癌诊断和预后风险评估。其中，非小细胞肺癌患者血清中DKK1抗体表达水平较健康人显著升高。具体地，根据本发明的实施例，所述DKK1自身抗体识别的抗原多肽以下列的至少一种形式提供：1)96孔板，所述96孔板的孔中包被所述DKK1自身抗体识别的抗原多肽；2)微球，所述微球偶联所述DKK1自身抗体识别的抗原多肽。根据本发明的一些具体示例，该试剂盒进一步包括：标准品，所述标准品为DKK1抗体(可以人工制备获得或通过市购获得)。由此，利用该试剂盒进行DKK1抗体水平检测和肿瘤诊断、预后风险评估时，结果更加可靠。在实际使用时，可以根据需要将所述标准品进行梯度稀释，所述梯度稀释的比例不受限制，只要方便后续绘制标准曲线即可。由此，利用该试剂盒进行DKK1抗体水平检测的结果可靠度高。根据本发明的实施例，该试剂盒进一步包括：阳性对照品，所述阳性对照品为DKK1抗体(可以人工制备获得或通过市购获得)。由此，利用该试剂盒进行DKK1抗体水平检测和肿瘤诊断、预后风险评估时，结果更加可靠。其中，当以96孔板的形式提供所述DKK1自身抗体识别的抗原多肽时，所述多肽设置于96孔板中，例如包被96孔板的孔(例如可以通过常规处理如借助包被液和阻滞液进行)。由此，可以方便地高通量地进行检测，可以进一步提高利用多肽检测肺癌或疑似肺癌患者的血液样品中的DKK1抗体的效率。进一步，试剂盒中还可以包含适于进行ELISA检测的其他试剂，例如冲洗缓冲液，样品稀释缓冲液，TMB底物溶液，反应终止液，辣根酶标记的二抗，阳性对照品，标准品。其中，所述标准品和所述阳性对照品均可以采用已知DKK1抗体。根据本发明的实施例，所述样品为血清。根据本发明的一些实施例，所述样品为疑似肿瘤患者或者肿瘤预后患者的血清。根据本发明的一些具体示例，所述肿瘤为肺癌，优选为非小细胞肺癌。根据本发明的实施例，所述样品为来自肺癌或疑似肺癌患者的血液样品。另外，利用该试剂盒还可以通过检测对象血液中DKK1自身抗体的存在，而对患者对治疗方法例如放射疗法的反应进行预后。需要说明的是，在本文中，有时也将“DKK1自身抗体识别的抗原多肽”简称为“多肽”，将“DKK1自身抗体”简称为“DKK1抗体”。下面通过具体实施例，对本发明进行解释。需要说明的是，下列实施例仅仅是说明性的，并不以任何方式限制本发明。另外，下列实施例中所采用的所有仪器、材料等均为市售可得的，如在下列实施例中没有明确指出的操作，可以通过本领域技术人员常规的操作方法进行。实施例1多肽的制备1.1一般方法依据DKK1蛋白(094907)的全长氨基酸序列(从蛋白质公共资源数据库uniprot获得)，将蛋白全长序列拆分成一组12个氨基酸长度的多肽，相邻多肽之间顺序重叠9个氨基酸残基，组成DKK1肽库，共计86条。DKK1蛋白全长(从N端到C端)：MMALGAAGATRVFVAMVAAALGGHPLLGVSATLNSVLNSNAIKNLPPPLGGAAGHPGSAVSAAPGILYPGGNKYQTIDNYQPYPCAEDEECGTDEYCASPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGICVSSDQNHFRGEIEETITESFGNDHSTLDGYSRRTTLSSKMYHTKGQEGSVCLRSSDCASGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTCQRH(SEQIDNO:5)。1.2原位合成制备多肽芯片(PiptideArray)根据蛋白及多肽氨基酸残基长度、重叠序列长度进行多肽合成仪ASPSL(德国，intavis公司)MutilPep合成控制程序设定，依据程序控制在每个合成周期添加一种特定氨基酸到活化的硝酸纤维素膜表面合成位点，并催化氨基酸之间肽键形成。合成肽链长度为12个氨基酸残基，需进行12个周期的反应，按照ASPSL多肽合成仪的操作流程，将20种FMOC-基团保护的天然氨基酸溶液放到机器上对应的位置。每个周期之间氨基酸要经过帽化，FMOC-基团脱保护等一系列的过程才能与下一个氨基酸结合，最后一个周期结束时，要将氨基酸的侧链保护基团脱掉。多肽芯片合成后在－20℃密封保存备用。实施例2筛选与肺癌相关的多肽(抗原表位的筛选)2.1多肽芯片的水化首先，将实施例1所制备的多肽芯片浸入40ml100％乙醇中，摇床上摇5分钟。然后，将该多肽芯片浸入40ml75％乙醇中，摇床上摇5分钟。接下来，将多肽芯片浸入40ml50％乙醇中，摇床上摇5分钟。接着，加入150mlPBS浸泡30分钟(以膜上的白点完全退色为准)。最后，将多肽芯片浸入40ml5％脱脂奶粉/PBS-T溶液中，室温下孵育3小时进行封闭。2.2多肽阵列与血清反应将9组非小细胞肺癌患者(每组八例患者)外周血血清等量混合制备成混合血清池，并将1组健康志愿者(每组八例健康者)外周血血清等量混合制备成健康混合血清池，然后分别进行下述操作：将混合血清池用5％脱脂奶粉/PBS-T溶液1:1000稀释制备成免疫反应液，将多肽芯片放入杂交袋内，按0.1ml/cm2加反应液，去除袋内所有气泡，封膜机封口，4℃轻轻振荡过夜。血清免疫反应结束后，剪开杂交袋，弃去反应液，PBS-T40ml洗多肽芯片3次，每次15分钟，将多肽芯片放入杂交袋内，加1：2000稀释的山羊抗人IgG溶液，按0.1ml/cm2加二抗反应液，封好杂交袋，4℃下轻轻振荡4小时，40mlPBS-T洗膜4次，每次15分钟。接下来，进行ECL显影，曝光，将胶片进行扫描，曝光结果用AlphaView软件系统分析图像。2.3筛选根据上述PiptideArray免疫反应结果，挑选与肺癌患者血清反应阳性而与健康对照组血清反应阴性的差异多肽点，共计23个。如表1所示，通过计算各差异多肽点的阳性频度值(组成多肽原位Dot-Blot膜，按照实施例1中所述制备方法，制备包含这23条多肽及对照在内的多肽芯片，通过与多例肺癌患者血清进行免疫反应计算各点阳性频度值)，进一步筛选出四个高频位点(SEQIDNO:1-4)，即为DKK1蛋白在非小细胞肺癌血清中的优势抗原识别表位。多肽芯片显影结果如图1所示。图1显示了多肽芯片1的显影结果，其中，A2-D21所示为DKK1蛋白肽库所在区域。表1顺序号名称序列阳性率％1SEQIDNO:1LYPGGNKYQTIDNYQPYP60％2SEQIDNO:2LNSNAIKNLPPPLGGAAG50％3SEQIDNO:3HFRGEIEETITE50％4SEQIDNO:4IQKDHHQASNSSRLH50％实施例3ELISA检验针对实施例2获得的SEQIDNO:1-4所示的多肽中的每一种以及四种多肽的混合物，分别以相应多肽为抗原包被96孔板，运用ELISA方法对下列样本进行DKK1自身抗体的检测：206例肺癌患者血清(包括经过不同治疗方法治疗后的患者血清)，99例健康人对照血清。针对SEQIDNO:1-4(有时也简称为SEQ1-4)所示的多肽中的每一种以及四种多肽的混合物(即SEQIDNO:1-4联用)，具体检测方法如下：首先，用多肽合成仪MultiPepRS按照序列表中氨基酸残基顺序合成多肽，并将所得到的肽偶联KLH，以便增加多肽的抗原性，有助于多肽包被到ELISA板底。接着，用pH9.6的碳酸盐缓冲液(NaCO30.159g，NaHCO30.293g，加水至100ml，pH值为9.6)稀释多肽至0.8μg/ml，以100μl/孔的量加入到96孔酶标板的孔中，封板膜密封后4℃过夜。接下来，弃去孔中的液体，PBS-T洗涤缓冲液(含0.1％Tween-20的PBS-T溶液配制为NaCl8g，KCL0.2g，Na2HPO4·12H2O3.58g,KH2PO40.24g加去离子水至1000ml，pH7.4，再加入Tween-201ml)洗涤酶标板3次，每次3min。接着，向孔中添加5％脱脂牛奶封闭缓冲液(5％脱脂牛奶配制为NaCl0.8g，KCL0.02g，Na2HPO4·12H2O0.358g,KH2PO40.024g，加去离子水至100ml，pH7.4，再加入Tween-200.5ml，脱脂奶粉5g)，每孔300μl，封板膜密封后37℃孵育1h。接着，添加待测样品。用5％脱脂牛奶封闭缓冲液稀释待测血清，稀释比例为1:100。完全弃去孔中液体，每孔加血清稀释液100μl，每例血清样本2个复孔，每板设立2个阳性对照孔，阳性对照为已知DKK1抗体表达阳性的混合血清，每板设立2个空白对照孔，加入0.1％PBS-T洗涤缓冲液。封板膜密封后4℃过夜。弃去孔中液体，洗涤酶标板3次，每次3min。接着，进行第二抗体免疫反应。利用5％脱脂牛奶封闭缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG，稀释比例1:2000，每孔加100μl，封板膜密封后37℃孵育1h。弃去孔中液体，洗涤酶标板3次，每次3min。接着，加底物显色。按照常规ELISA试剂盒说明书(本实施例采用康为世纪TMB显色试剂盒)，加入显色底物，每孔加入100μl，室温避光条件下显色25min，每孔加入50μl2MH2SO4终止反应。接着，酶标仪450nm波长条件下测定光密度OD值。最后，基于所得的光密度OD值，再与预定参考值X的比较，确定待测样本是否来源于非小细胞肺癌患者。例如，如果待测样本中的识别抗体相对浓度高于X，则待测血清为疑似非小细胞肺癌患者血清。其中，X为健康人中非小细胞肺癌患者和健康人血清抗体相对浓度的受试者工作曲线(ROC曲线)最优点下的相对浓度。本实施例采用206例非小细胞肺癌患者血清样本和99例健康人血清样本，分别计算出各个序列的X值分别为0.49、0.45、0.38和0.37，并利用多肽检出的自身抗体作为诊断标志物进行分析。然后，按照以下公式计算各个多肽自身抗体单独使用或联合使用在肺癌患者诊断中的特异性、敏感性以及阴性阳性预测值：敏感性＝(a/a+c)×100％特异性＝(d/b+d)×100％阳性预测值＝(a/a+b)×100％阴性预测值＝(d/c+d)×100％结果见图2-4、表2-3。其中，图2显示了各待测样本中的SEQ1-4抗体水平检测结果。如图2所示，肺癌患者血清中SEQ1-4抗体水平均显著高于健康人群血清(即OD值升高了两倍以上)。SEQIDNO:1-4所示的多肽单独使用及联合使用的检测效能和敏感性、特异性等分析结果，见图3和表2-3。表2序列诊断效能敏感性特异性阳性预测值阴性预测值SEQ10.744(0.684-0.799)46.4％90.1％82.1％41.8％SEQ20.809(0.756-0.854)64.0％82.0％87.5％53.7％SEQ30.740(0.684-0.791)66.0％69.4％82.9％48.0％SEQ40.767(0.712-0.814)77.7％62.1％80.2％58.4％SEQ1-联用0.821(0.764-0.868)58.1％85.5％81.0％79.6％表3图4显示了SEQIDNO:1-4所示的多肽单独使用对各肺癌患者预后情况与DKK1抗体水平的关系的检测结果，具体为DKK1抗体不同表达水平的肺癌患者的三年总生存期和中位生存期之间的关系图。如图4所示，SEQ2-4对患者的生存预后具有显著的风险评估作用，自身抗体表达阳性(即自身抗体表达较高的)的患者，三年总生存期显著高于表达阴性(即自身抗体表达较低)的患者，中位生存期分别为自身抗体表达阳性患者32个月，自身抗体表达阴性(即自身抗体表达较低)患者17个月。表明利用本发明的上述DKK1自身抗体识别的抗原多肽，通过免疫印迹检测等手段检测待测者血清中的DKK1抗体水平，进而基于待测者血清DKK1抗体表达升高水平的程度不同，能够有效进行非小细胞肺癌的预后风险评估。并且，患者血清来源于经过不同治疗方法治疗后的患者，而利用本发明的方法检测得出的结论则排除了治疗方案的干扰和偏向。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。当前第1页1 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