植物α淀粉酶在导致花粉败育中的应用的制作方法

本发明属于植物分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种植物α淀粉酶在导致花粉败育中的应用，还涉及结合该营养，利用现代生物技术，应用于杂交种子生产技术体系，保证制种质量，以及提高制种效率；也可以应用于防止转基因扩散。

背景技术：

植物杂种优势利用是最为经济有效的提高粮食产量的途径之一，但其仍存在一些限制因素，例如组合优良难度较大、杂交作物所占的比重较小等。虽然几乎所有的农作物都已最大的可能利用杂种优势，但仍蕴藏着巨大的潜力。因此诸多学者进行研究，尤其是水稻，其杂种优势主要途径由“三系法”到“两系法”，提高了配组自由度，提高了水稻杂种优势水平。但“两系法”的温敏不育系受温度的影响过大，会造成制种失败，损失严重。由于雄性不育系的资源有限，严重制约水稻杂交技术。

90年代初，Mariani等人利用来自烟草的花药绒毡层的特异启动子(TA29)和核糖核酸酶基因(Barnase)重组表达盒转化烟草和油菜，并成功获得雄性不育系，开创了人工制备雄性不育系的新途径(Denis M,Delourme R,Gourret J P,et al.Expression of engineered nuclear male sterility in Brassica napus(genetics,morphology,cytology,and sensitivity to temperature)[J].Plant Physiology,1993,101(4):1295-1304.)。当前，很多研究表明分析其他功能基因也可能通过基因工程方法构建转基因雄性不育植株。

植物雄性不育主要表型，体现在花粉败育，它涉及到花器官中雄蕊的发生与发育、绒毡层结构、小孢子形成、花药开裂以及外部生态环境等众多环节或因素，其中弄清花粉发育的全过程和分子机理是研究植物雄性不育的基础和关键所在。而花粉发育涉及到众多基因的表达调控，其中了解到在花粉发育后期，淀粉能为花粉萌发和花粉管延伸储备能量。因此，当花粉粒中的淀粉提前被α-淀粉酶降解，使得花粉粒能量来源被瓦解，从而遏制花粉的生长，出现畸形花粉粒，导致植物雄性不育。

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，主要分布在动植物、细菌和真菌，人们通过利用基因工程技术，已经克隆出了各种淀粉酶基因的cDNA序列(崔锦,马向东(2009)淀粉酶基因的多样性.郑州牧业工程高等专科学校学报,29(2):21-23)。同时对淀粉酶的多样性进行了研究，表明除了在来源多样性外，其基因结构和功能方面皆呈现多样性。根据其对淀粉酶的作用方式不同进行分类，α-淀粉酶属于内切型淀粉酶，可以从淀粉分子的内部随机切割α-1，4糖苷键，使淀粉水解成麦芽糖、葡萄糖等，释放能量(Morris G P,Beck P L,Herridge M S,et al.Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon[J].Gastroenterology,1989,96(3):795-803.)。因此，在成熟花粉中，适量的淀粉酶可水解淀粉，为花粉的正常发育和花粉管的萌发、生长提供能量。相反，若在花粉形成过程中淀粉酶过表达和沉默表达，都会降低花粉能量代谢水平，导致淀粉积累量不足，产生败育花粉。而在水稻花粉败育基因方面的研究，鲜少报道。

这些败育基因为水稻通过基因工程实现不育系转基因植株的获得，特别是在控制育性和转基因漂移等方面提供了新的选择。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种植物α淀粉酶在导致花粉败育及制备转基因花粉败育植株中的应用。

为了达到以上目的，本发明提供的植物α淀粉酶的核苷酸序列为：

1)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或

2)在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列；或

3)在严格条件下与SEQ ID NO.1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明还提供与植物α-淀粉酶核苷酸序列互补的DNA分子。本领域技术人员根据相同目的能够容易地鉴定并利用与植物花粉败育基因α-淀粉酶核苷酸序列互补的DNA分子，因此，具有启动子活性并在严格条件下与本发明败育基因α-淀粉酶序列或其片段杂交的分离序列包括在本发明中。其中，所述核苷酸序列互补，是指在严格条件下能与α-淀粉酶DNA序列杂交。

严格条件是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针长度短于大约1000个核苷酸，优选地短于500个核苷酸。

典型地，严格条件是在pH值7.0-8.3下盐浓度低于大约1.5M Na离子，典型地大约0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐类)，温度对短探针(如10-50个核苷酸)至少大约30℃，对长探针(如超过50个核苷酸)至少大约60℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可获得严格条件。低严格条件，例如，包括在30-35％甲酰胺、1M NaCl、l％SDS(十二烷基磺酸钠)的缓冲溶液中37℃杂交，在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中50-55℃洗涤。中度严格条件，例如，包括在40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、l％SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.5×至1×SSC中55-60℃洗涤。高度严格条件，例如，包括在50％甲酰胺、1M NaCl、l％SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.1×SSC中60-65℃洗涤。非必要地，洗涤缓冲液可含有大约0.1％-1％的SDS。杂交时间一般少于大约24小时，通常大约4-12小时。

特别典型地是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可以从Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284的方程估算:Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％form是甲酰胺在杂交溶液中的百分比，L是杂交体在碱基对中的长度。Tm是50％互补靶序列与完全配对探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH下)。每1％的错配需Tm降低大约l℃；因此，Tm杂交和/或洗涤条件可被调节以与所需同一性的序列杂交。例如，如果探寻的序列具有≥90％的同一性，Tm可以降低10℃。一般地，选择的严格条件是低于特定序列的热解链温度(Tm)大约5℃，且其在规定的离子强度和pH下互补。但是，高度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。应用此方程、杂交和洗涤组合物和所需的Tm，本领域普通技术人员会理解杂交和/或洗涤溶液的条件随严格度的变化而变化。如果所需的错配程度使Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度以能够使用较高的温度。核酸杂交的指南见于Tijssen(1993)生物化学和分子生物学实验室技术一用核酸探针杂交，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel等人编辑(1995)分子生物学现代方法第2章(Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York)。见Sambrook等人(1989)分子克隆:实验室手册(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NewYork)。

所述严格条件优选为在6×SSC(柠檬酸钠)、0.5％SDS(十二烷基磺酸钠)的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。

其中，关于α-淀粉酶多核苷酸序列在本领域有被报道，在基因数据库(The GenBank)公开序列，陆续出现有关分析、鉴定基因的网站，包括：NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、Gramene(http://gramene.org/)、UniProt(http://www.uniprot.org/)以及EMBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk/)等。例如，分别在各个网站中的α-淀粉基因名称和序列编号如下表1：

表1

进一步地，本发明所述的植物α淀粉酶的氨基酸序列为：

(a)由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白；或

(b)将SEQ ID NO.4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.4衍生的且保持SEQ ID NO.4所示的蛋白功能的蛋白。

本发明提供一种在植物中导入植物α淀粉酶在导致花粉败育中的应用，包括：

a)一段核苷酸片段，包含植物α淀粉酶基因序列，所述序列紧密连接于花粉或花药特异性启动子；

b)将a)所述植物α淀粉酶基因导入植物组织中；

所述植物α淀粉酶基因具有：

1)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或

2)在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列；或

3)在严格条件下与SEQ ID NO.1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明提供了上述植物α淀粉酶或其编码基因或含有该编码基因的生物材料在导致植物花粉败育中的应用。

本发明提供了上述植物α淀粉酶或其编码基因或含有该编码基因的生物材料在制备花粉败育转基因植株中的应用。

本发明所述的生物材料是指重组表达载体、表达盒、宿主菌或宿主细胞。

本发明含有上述的植物α-淀粉酶的重组表达载体可通过农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等常规生物学方法转化植物细胞或组织获得独立的转基因细胞或组织，获得雄性不育的转基因株系。

所述转基因植物为外源基因在花粉中特异表达的转基因植物，优选为授粉/受精能力增强/削弱的转基因植物，更优选为雄性不育转基因植物。

本发明所述的生物材料还含有转导肽和雄性配子优先型启动子。

本发明提供了能使花粉败育的有效连接序列的植物表达载体，包含有效连接调控的表达盒，其中所述在有效连接调控的表达盒含有由SEQ ID No.1-3所示的DNA片段所形成。该表达盒为在花粉败育基因α-淀粉酶的上游连接有PG47启动子和SBE信号肽能够有效干扰花粉粒中淀粉积累和堆积基因表达盒。

其中，SEQ ID No.1所示的序列长度为1278bp的是花粉败育基因α-淀粉酶正向DNA片段；SEQ ID No.2所示的序列长度为216bp的转导肽；SEQ ID No.3所示的序列长度为2732bp的雄性配子优先型启动子PG47。

本发明进一步提供含有上述花粉败育基因的α-淀粉酶基因表达盒的植物花粉。

本发明还提供驱动外源基因导致花粉败育表达的方法，包括如下步骤：将花粉败育基因α-淀粉酶和目的外源基因导入到载体中得到含有花粉败育基因α-淀粉酶和目的外源基因的表达盒重组表达载体，并将其引入植物基因组，得到外源基因在花粉中特异表达的转基因植物。

本发明提供了一种调控植物花粉发育的方法，其特征在于，使植物表达上述植物α淀粉酶基因。

所述的植物为禾本科植物。

优选地，所述植物包括而不限于水稻、玉米、高梁、大麦、燕麦、小麦、粟、甘蔗、大豆、芸苔属物种、棉花、红花、烟草、苜蓿和向日葵。

所述的调控是降解植物花粉中淀粉酶或诱导植物雄性不育。

本发明提供了一种降解植物花粉中外源基因扩散的方法，将含有上述植物α淀粉酶基因的表达盒转化愈伤组织，将转化后的愈伤组织进行诱导分化获得转基因花粉败育的转基因植株，使转基因植株花粉无法正常授粉，进而降解植物花粉中外源基因扩散。

本发明提供的花粉败育基因α-淀粉酶优点如下：

1)植物α-淀粉酶作为花粉败育基因可来自水稻、高粱、大麦、小麦等，其中来自水稻α-淀粉酶为内源基因，对水稻基因工程有利。

2)植物α-淀粉酶基因花粉粒碘染实验表明，α-淀粉酶能在启动子PG47驱动下，能精确地作用于花药中花粉粒，使得可育花粉和败育花粉的比例符合为1:1。

3)本发明植物α-淀粉酶基因表达水平精确，可控制转基因扩散；可用于保持雄性不育系的保持和繁殖，同时在杂交制种过程中省去人工去雄步骤，应用前景广阔。

4)本发明为获得转基因雄性不育植株提供了一种新方法。

附图说明

图1是实施例2中花粉败育基因α-淀粉酶的重组表达载体DX2182-α-Amylase构建流程图。

图2是实施例4中DX2182-α-Amylase转基因水稻花粉碘染照片。A图是水稻可育对照花粉碘-碘化钾染照片，全部花粉可育并且可以碘染着色。B图是水稻花粉特异性表达α-淀粉酶花粉染色，其中一半花粉败育无法染色，白色箭头指向可染色花粉，黑色箭头指向染不上色花粉。

图3是实施例5DX2182-α-Amylase植物重组表达载体的转基因植物潮霉素筛选T1代种子，获得T2代植株。A图为非转基因水稻种子潮霉素发芽。B图为转基因α-淀粉酶水稻种子潮霉素发芽。C图为非转基因水稻成熟胚潮霉素发芽。D图为转基因α-淀粉酶水稻成熟胚潮霉素发芽。箭头所指为代转基因α-淀粉酶成熟胚可以发芽。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1水稻α-淀粉酶基因获取

1、水稻日本晴RNA的提取

利用Biozol Reagent方法提取水稻日本晴RNA：称取0.1g日本晴新鲜幼穗组织1ml Biozol Reagent的比例混匀，室温静置5min；按每1ml Biozol Reagent加0.2ml氯仿，用力震荡15s，待溶液充分乳化后，再室温静置5min，12000rmp，4℃离心15min；从离心机中小心取出离心管，吸取上清液转移至另一新的离心管中；向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在室温下静置10min,12000rmp，4℃离心10min；弃上清，管壁可现白色沉淀，加0.5ml 75％乙醇(用灭菌后DEPC水配置)洗涤，颠倒混匀，10000rmp，4℃离心5min；重复一次，低温干燥，使乙醇挥发；加50ul的Rnase-free水溶解沉淀，置于-80℃保存。

2、获得日本晴的cDNA

以日本晴RNA为模板，利用逆转录酶M-MLV逆转录，具体方法如下：(1)冰上配置，混匀。

RNA 5-10μl

Olig(dT) 2μl

RNase-free H₂O 至14.5μl

(2)70℃，5分钟，立刻置于冰上，打开二级结构。

(3)加入反转录酶等，混匀。

(4)42℃，延伸90分钟。70℃，15分钟。获得日本晴的cDNA分装保存于-40℃。

注：所有实验用品均为RNase-free。

3、设计合成克隆水稻α-淀粉酶的引物

通过NCBI数据库获得水稻日本晴的α-淀粉酶(OS01G0715400)基因的核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO.1所示)，其氨基酸序列(如序列表中SEQ IDNO.4所示)。OsAmylase核苷酸序列是通过设计引物序列(如序列表中SEQ ID NO.5-6从日本晴的cDNA中克隆获得。引物设计使用Gibson Assembly方法，扩增产物插入到DX2182载体MluI和Sac1单酶切位点。扩增α-淀粉酶基因引物对如序列SEQ ID NO:5-6所示。其中上下游引物5’端均有15个左右核苷酸序列与载体相应连接位置重复，以便Gibson Assembly连接。扩增体系及程序如下：

PCR程序:预变性94℃3min，变性94℃30s，退火55-65℃40s，延伸68℃1min20s，35个循环，延伸68℃10min。

实施例2构建水稻α-淀粉酶的重组表达载体DX2182-α-Amylase

构建流程见图1，将实施例1扩增产物插入DX2182载体Mlu1和Sac1酶切位点。

引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6扩增PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳回收1300bp左右产物。Mlu1和Sac1酶切载体DX2182，回收线性酶切载体。

2X连接试剂盒连接败育基因到DX2182，10ul体系如下：

2.5μ1α-淀粉酶PCR产物(50ng)，2.5μ1酶切载体(100ng)，5μ1Ligation Mix，连接程序：50℃60分钟。

转化：取上述连接产物2μ1电击转化大肠杆菌感受态细胞。挑选阳性克隆测序。命名为DX2182-α-Amylase。DX2182-α-Amylase载体含有潮霉素抗性基因，其序列如SEQ ID NO.7所示，可用潮霉素筛选，获得抗性植株，同时还可以用筛选转基因T0代种子，获得转基因植株T1代抗性植株。

实施例3转基因水稻植株的获得

取-70℃保存的农杆菌EHA105于含Kan(50μg/ml)+Rif(25μg/ml)+链霉素(50μg/ml)平板划线，28℃培养。挑取单菌落接种于50ml YEB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16hr。取2ml菌液转接于100ml(含有抗生素)YEB液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600＝0.5。冰上预冷10分钟，5000rpm 10min(冷冻离心机预冷到4℃)。无菌去离子水洗2次(每次10ml)，10％甘油洗1次溶于3ml 10％甘油中。取100μl感受态细胞加1μl实施例1中得到的DX2182-α-Amylase质粒，2.5KV电击转化。在含有卡那霉素和利福平的YEB培养板上28℃培养，挑选阳性克隆，用DX2182-α-Amylase载体特异性引物SEQ ID NO.8-9PCR验证。

验证正确的克隆，通过农杆菌介导的遗传转化法侵染水稻中花11(Hiei Y Ohta S,Komari T,Kumashiro T(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant Journal6:271-282)。经共培养、筛选、分化、生根等环节获取T0代转基因幼苗，提取DNA，经PCR验证的转基因阳性植株，自交结实获得T1代。取T1植株进行后续分析。

实施例4转基因水稻碘化钾染色分析

配制碘化钾染色液容液(取2g KI溶于5-10mL蒸馏水中，然后加入1g I2(用适量的无水乙醇溶解)，待全部溶解后，再加蒸馏水定容至300mL。贮于棕色瓶中备用)。对水稻转基因植株的成熟花粉进行镜检，对转基因植株的花粉粒育性进行分析，具体方法如下：

1、花粉采集：取充分成熟将要开花的花药，剥除颖壳，取出花药。

2.镜检：按碘化钾：去离子水＝1:1的比例稀释碘化钾溶液，取70ul的稀释液置于载玻片，取一花药置于载玻片上，用镊子将花药充分捣碎，使花粉粒释放，盖上盖玻片，于低倍显微镜下观察。凡被染成蓝色的花粉粒为可育花粉，呈黄褐色的为败育的花粉粒。

转基因植株的花粉粒经碘化钾染色分析，花粉粒碘染结果表明可育花粉：败育花粉符合1:1的分离比例，即为部分花粉表现为雄性不育(50％)，均有一半(50％)不能染成黑蓝色(如图2的B图所示，50％正常的花粉染色)。而野生型(或其他不携带花粉败育基因的转基因植株)则是完全雄性可育的(如图2的A图所示，100％正常的花粉染色)。表明水稻α-淀粉酶能在水稻花粉中降解淀粉，因此在花粉粒在发育过程中，能量供给不足，导致花粉败育。

由此证明α-淀粉酶基因能够降解花粉粒中的淀粉，造成水稻转基因花粉不育，有效阻止转基因作物通过花粉将转基因元件传播给其他野生作物品种。

综上所述，本发明影响雄性生育力的蛋白质α-淀粉酶为克隆自水稻品种α-淀粉酶，并且能够降解花粉粒中的淀粉，造成水稻转基因花粉不育，准确性高，有效阻止转基因作物通过花粉将转基因元件传播给其他野生作物品种；可用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态；同时省去了杂交制种过程中去雄的步骤。

实施例5对转基因水稻T1代种子潮霉素筛选

由重组植物表达载体DX2182-α-Amylase的转基因植株，收获T1代种子。根据实施例4中，可育花粉：败育花粉符合1:1的分离比例，即是一半种子为非转基因种子，一半为转基因种子，因此利用潮霉素进行筛选转基因种子，诱导转基因T2代植株。通过两种方案验证：

(1)400mg/L潮霉素筛选T1代种子

以非转基因ZH11为对照，在400mg/L潮霉素下，筛选含α-淀粉酶的花粉败育基因重组载体的T1代种子，分别选取100粒，进行筛选。7d后观察其发芽率。结果表明7d后观察出芽率，14d后统计其存活率与死亡率＝47:53，基本符合1:1的分离比例(如图3的A图和B图)

(2)35mg/L潮霉素+MS培养基筛选T1代成熟胚

以非转基因ZH11为对照，在35mg/L潮霉素+MS培养基上，筛选含α-淀粉酶的花粉败育基因重组载体的T1代种子的成熟胚，分别选取100粒，进行筛选。7d后观察其发芽率。结果表明7d后观察出芽率，统计其存活率与死亡率＝51:49，基本符合1:1的分离比例，如图3的C图和D图。

参照实施例2-5的方法，对SEQ ID NO.10-19所述的植物α淀粉酶基因进行重组载体构建、转基因植物制备及功能验证，结果与实施例4/5结果类似，表明植物α-淀粉酶能在作物花粉中降解淀粉，因此在花粉粒在发育过程中，能量供给不足，导致花粉败育，造成转基因作物花粉不育，有效阻止转基因作物通过花粉将转基因元件传播给其他野生作物品种。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。