一种青蒿HD‑ZIPIV类转录因子编码序列及应用的制作方法

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种青蒿HD-ZIP IV类转录因子编码序列及应用。

背景技术：

植物新陈代谢分为初生代谢和次生代谢，初生代谢产物(如糖类、脂类和核酸)存在于所有植物中，是维持细胞生命活动所必需的，而植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布具有种属、组织器官和生长发育特异性。大多数植物叶片表面并不是光滑的，而是具有许多类型的毛状结构。根据其功能和形态分为两大类：一类是不具有分泌功能的纤毛；另一类是具有分泌功能的腺毛。前一类的主要代表是棉花的棉纤维，它是棉花种子表皮特化的单细胞纤毛。而分泌型腺毛是植物表皮细胞特化出的一种多细胞结构，近年来对腺毛的研究发现，许多有价值的次生代谢产物都是在这一结构中特异性合成和储存。比如以薄荷精油，玫瑰精油为代表的一大类天然香精香料；以青蒿素为代表的中草药有效成分；以啤酒花为代表的天然植物添加剂。

在天然植株中产生的次生代谢产物含量极低，而使用化学合成的方法，工艺流程复杂、成本高，并且很多次生代谢产物添加到食品化妆品行业，使用天然的植物材料更加安全。因此，研究人员开始探索其他的提高植物次生代谢产物含量的方法，在诸多方法之中，提高腺毛密度被认为是一种直接有效的方法。在腺毛中特异性合成的次生代谢产物有个共同的特点，即参与这些次生代谢产物合成的关键酶基因只在腺毛中特异表达。因此，利用基因工程的方法调控腺毛密度是颇具应用价值的植物遗传操作手段。

近年来，在非分泌型的单细胞腺毛发育调控中，研究人员已经取得了很多成果。比如，在模式植物拟南芥中，单细胞纤毛的发育调控机制已经基本清楚。在有重要经济价值的棉花中，单细胞纤毛(棉纤维)的发育调控机制也取得了很多的研究成果。而在次生代谢领域，关于分泌型腺毛的报道还比较少。特别是在传统中草药青蒿的研究中，研究主要集中在对合成关键酶基因的转录调控方面，还没有调控腺毛密度的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的不足,提供一种青蒿AaHD1蛋白编码序列，该基因编码HD-ZIP IV类转录因子(AaHD1)，它参与调控青蒿腺毛的密度；利用转基因技术将青蒿AaHD1转录因子超表达载体转化青蒿可以有效调控青蒿表皮的腺毛密度，从而提高青蒿素的含量。在非转基因普通青蒿的叶片表皮腺毛密度为15个每平方毫米，超表达AaHD1基因表达的转基因青蒿的叶片腺毛密度提高到25个每平方毫米。与之对应的青蒿素含量从非转基因青蒿的9mg/g DW提高到13mg/g DW，该发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。

本发明是通过以下的技术方案实现的：

本发明提供了一种青蒿HD-ZIP IV类转录因子编码序列，所述编码序列记为AaHD1，所述AaHD1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种重组表达转化体，所述重组表达转化体包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了青蒿HD-ZIP IV类转录因子编码序列AaHD1在提高青蒿素含量中的应用。

进一步地，所述应用包括以下步骤：

步骤1、将青蒿HD-ZIP IV类转录因子编码序列AaHD1连于植物表达调控序列上，构建含所述青蒿HD-ZIP IV类转录因子编码序列的植物表达载体；

步骤2、将步骤1中的所述植物表达载体转入农杆菌，将所述农杆菌转入青蒿；

步骤3、通过抗生素筛选，获得含有所述青蒿HD-ZIP IV类转录因子编码序列AaHD1的转化细胞，再生转基因植株。

进一步地，在上述步骤2中，采用冻融法进行转入。

本发明还提供了一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1、对青蒿栽培种H-ZIP IV类转录因子分析，从青蒿cDNA文库中克隆得到青蒿HD-ZIP IV类转录因子AaHD1；

步骤2、将AaHD1基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含所述AaHD1基因的植物超表达载体；

步骤3、将含所述AaHD1基因的植物超表达载体转化根癌农杆菌，获得具有所述植物超表达载体的根癌农杆菌菌株；

步骤4、利用所述根癌农杆菌菌株转化青蒿，经潮霉素筛选得到抗性苗，再经PCR检测为阳性的植株即为转基因青蒿苗；

步骤5、对获得的转基因青蒿进行腺毛密度分析，获得腺毛密度显著提高的转基因青蒿，进而获得青蒿素含量提高的青蒿植株。

进一步地，所述根癌农杆菌为EHA105。

进一步地，步骤4中，所述的经PCR检测的转基因青蒿植株是指，分别设计合成AaHD1基因的检测引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为转基因青蒿植株，所述的腺毛密度检测是指在荧光显微镜下，青蒿分泌型腺毛在特定波长下显示明亮荧光，经拍照后再统计其数量和密度。

其中，对获得的转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定。

本发明从青蒿中克隆AaHD1基因，构建含AaHD1基因的植物超表达载体，用根癌农杆菌介导，采用叶盘法将AaHD1基因超表达载体转化青蒿；PCR检测外源目的基因AaHD1的整合情况，通过荧光显微镜观察和统计腺毛密度，获得了腺毛密度显著提高的转基因青蒿；高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定青蒿中青蒿素含量，表明获得的青蒿表皮腺毛密度显著提高的转基因青蒿中的青蒿素含量也显著提高。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的青蒿AaHD1蛋白多肽时，可以将青蒿AaHD1蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成青蒿AaHD1蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1示出了本发明较优实施例中定量PCR检测AaHD1-OX青蒿中AaHD1表达量的结果；

图2示出了本发明较优实施例中用荧光显微镜观察野生型青蒿叶片腺毛的结果；

图3示出了本发明较优实施例中用荧光显微镜观察AaHD1-OX青蒿叶片腺毛的结果；

图4示出了本发明较优实施例中的腺毛密度统计结果；*，P<0.01(T检验)；

图5示出了本发明较优实施例中使用HPLC检测青蒿素含量的结果；*，P<0.01(T检验)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、青蒿AaHD1基因的克隆

1.青蒿基因组总RNA的提取

取青蒿叶片组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mL Eppendorf(EP)离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

2.青蒿AaHD1基因的克隆

以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成cDNA；根据AaHD1基因的序列设计基因特异性引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)，通过PCR从总cDNA中扩增AaHD1基因，并测序。

通过上述步骤，获得了青蒿中该转录因子的全长编码序列(SEQ ID NO:1)并推导出其蛋白编码序列(SEQ ID NO：2)，其中，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。

实施例2、含AaHD1基因的植物双元干扰表达载体的构建

为研究AaHD1基因对青蒿分泌性腺毛发育的影响，构建AaHD1过量表达的超表达载体PHB-AaHD1。为了方便表达载体的构建，正向引物中引入了BamH1的酶切位点，反向引物中引入了Xho1的酶切位点，引物如表1所示；

表1PHB-AaHD1载体构建的PCR引物

本实施例将青蒿AaHD1基因可操作性地连接于表达调控序列，该载体可用于通过发育调控策略来调控青蒿中青蒿素的含量。

实施例3、根癌农杆菌介导的AaHD1干扰载体遗传转化青蒿获得转基因青蒿植株

1.含AaHD1超表达载体的根癌农杆菌工程菌的获得

将实施例2中含AaHD1的植物双元超表达载体采用冻融法转入根癌农杆菌(如EHA105，为市场有公开出售的生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar 1)，并进行PCR验证。结果表明，含AaHD1的植物双元干扰表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。

2.根癌农杆菌介导AaHD1基因转化青蒿

2.1.外植体的预培养

青蒿种子用75％乙醇浸泡1min，再用20％NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(Murashige and Skoog,1962)固体培养基中，25℃、16h/8h(光亮/黑暗)光照培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化。

2.2.农杆菌与外植体的共培养

将所述的叶片外植体，转到共培养培养基(1/2MS+AS 100μmol/L)中，滴加含活化好的所述含AaHD1植物双元超表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d。以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。

2.3.抗性再生植株的筛选

将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+Hyg 50mg/L+Cb 500mg/L)上于25℃、16h/8h光照培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Hyg抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培养至生根，从而获得Hyg抗性再生青蒿植株。

3.转基因青蒿植株的PCR检测

根据目的基因所在表达盒上游的35S启动子区域和AaHD1分别设计正向引物设计和反向引物对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段。而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。

本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含AaHD1植物双元超表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株。转基因青蒿植株的获得为筛选获得较高青蒿素含量的青蒿株系提供了直接素材。

实施例4、转基因青蒿表皮腺毛密度和总腺毛数量的统计

使用奥林巴斯公司的BX51型号显微镜，在波长为450nm-480nm的激发光下观察非转基因青蒿和转AaHD1超表达载体青蒿的叶片。取同等大小的青蒿叶片，在不同的5个位置随机取样，统计腺毛密度。

在本发明中转AaHD1超表达载体青蒿的腺毛密度显著提高。在非转基因青蒿的腺毛密度为15个每平方毫米时(图2)，AaHD1基因超表达的转基因青蒿的叶片腺毛密度提高到25个每平方毫米(图3)。图1示出了定量PCR检测AaHD1-OX青蒿中AaHD1表达量的结果；图2示出了用荧光显微镜观察野生型青蒿叶片腺毛的结果；图3示出了用荧光显微镜观察AaHD1-OX青蒿叶片腺毛的结果；图4示出了腺毛密度统计结果，*，P<0.01(T检验)。可见在青蒿中AaHD1的超表达提高了腺毛密度。

实施例5、利用HPLC-ELSD测定转基因青蒿中青蒿素含量

1.HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制

HPLC：采用water alliance 2695系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱(SymmetryShieldTM C18，5μm，250×4.6mm，Waters)，流动相为甲醇:水，甲醇:水的体积比为70:30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，灵敏度(AUFS＝1.0)，理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。

ELSD：采用water alliance 2420系统,蒸发光散射检测器漂移管温度40℃,放大系数(gain)为7，载气压力5bar；

精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素标准品溶液，保存于-20℃备用。

本发明中流动相为甲醇(methanol):水，比例为70％:30％时，青蒿素的保留时间为5.1min,峰型良好。理论塔板数按青蒿素计算不低于2000。

2.标准曲线的制作

将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2μl，4μl，6μl，8μl，10μl记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X,μg)进行回归分析。通过研究，本发明中青蒿素在4-20μg范围内呈现良好的log-log线性关系。青蒿素对照品的log-log线性回归方程为：Y＝1.28e+000X+4.71e+000，R＝0.979546。

3.样品的制备和青蒿素含量的测定

在青蒿植株的上，中和下部共取2g新鲜的青蒿叶片，于45℃烘箱中烘至恒重。然后从烘干的枝条上敲下叶，磨成粉末。称取约0.1g干粉于2mL Eppendorf管中，加入2mL乙醇，用40W超声波处理30min，5000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤，即可用于HPLC-ELSD测定青蒿素的含量。

采用HPLC-ELSD测定青蒿素含量，样品进样体积为20μl,根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的青蒿素含量(mg)，再除以样品的青蒿叶干重(g)，从而计算出青蒿植株中青蒿素的含量。

在本发明中转AaHD1超表达载体的转基因植株可显著提高了青蒿中青蒿素含量。在非转化普通青蒿含量为9mg/g DW时，同时期转AaHD1超表达载体青蒿中青蒿素的含量平均达到13mg/g DW，其含量是非转化青蒿含量的1.4倍，如图5所示，转AaHD1超表达青蒿中，使用HPLC检测青蒿素，结果为三次重复的平均值，误差线表示标准差。统计分析用t-test检验(*，P<0.01)。

本实施例采用HPLC-ELSD法测定了转基因青蒿中青蒿素含量，采用转化AaHD1超表达载体代谢工程策略发现AaHD1基因的表达与青蒿素的含量具有明显的关联关系，为利用该基因进行过表达研究进而提高青蒿中青蒿素的含量提供了有力的实验证据。

本发明的青蒿HD-ZIP IV类转录因子编码序列AaHD1能够实现提高植物中青蒿素含量，将所述编码序列连于植物表达调控载体上，构建含所述编码序列的植物表达载体；将表达载体转入农杆菌，将农杆菌转入青蒿；通过抗生素筛选，获得含有所述编码序列的转化细胞，再生转基因植株；本发明获得的转基因青蒿中青蒿素的含量受到显著调控，在非转化普通青蒿含量为9mg/g DW时，同时期转AaHD1超表达载体青蒿中青蒿素的含量平均为13mg/g DW，其含量是非转化青蒿含量的1.4倍。本发明提供了一个调控青蒿中青蒿素含量的转录因子编码序列，为利用该编码序列大规模生产青蒿素打下了坚实的基础。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。