人乳腺癌细胞株特异性核酸适配体及其在制备检测、诊断和治疗人乳腺癌制剂中的应用的制作方法

本发明属于生物医学与临床医学技术领域，涉及人乳腺癌细胞株特异性核酸适配体及其在制备检测、诊断和治疗人乳腺癌制剂中的应用，特别涉及一种人乳腺癌细胞株SK-BR-3特异性核酸适配体及其在制备人乳腺癌的检测和诊断试剂盒以及治疗性药物或者制剂中的应用。

背景技术：

乳腺癌是一种高度异质化的肿瘤，其在女性群体中的发病率仅次于肺癌，是世界上女性罹患的第二大肿瘤疾病。近年来，乳腺癌的发病率和死亡率都有上升的趋势，给人们的生命财产带来了巨大的威胁。而乳腺癌的早期诊断和治疗则能够在很大程度上控制肿瘤的恶化进程，提高肿瘤病人的康复率。因此，研发一种高效、快速、特异和灵敏的人乳腺癌的早期诊断和治疗方法对战胜乳腺癌具有非常重要的临床意义。

核酸适配体(aptamer)是上世纪90年代发展起来的，通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)，以靶标包括蛋白、多肽、小分子、细胞等与人工设计和合成的RNA/单链DNA随机文库孵育，经过多轮重复筛选得到的一段能够与靶标特异性结合的短寡核苷酸片段。与抗体相比，核酸适配体对靶物质的结合表现出更强的亲和性、特异性和稳定性，因而被形象地称为“化学抗体”。近年来在SELEX技术的基础上发展起来的Cell-SELEX技术，由于能够实现完整复杂系统靶标的核酸适配体的筛选，而受到大家的追捧。通过Cell-SELEX技术筛选得到的核酸适配体，其特异性、亲和性和实用性都得到了很大的提高。此外，核酸适配体分子量小、获取途径简单、易修饰、无免疫原性，在生物传感、生物识别、分子影像、药物输送等生物医学领域具有广阔的应用前景。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性高、亲和性强、稳定性好和实用性广的人乳腺癌细胞株SK-BR-3特异性核酸适配体及其衍生物。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种用于检测和诊断人乳腺癌的试剂盒。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种分子探针。

本发明还要解决的技术问题是提供了该核酸适配体及其衍生物在制备人乳腺癌检测和诊断试剂盒以及治疗性药物或者制剂中的应用。

技术方案：本发明提供了一种特异性识别和结合人乳腺癌细胞株的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6中的任意一条或几条序列所示；或者在SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6中的任意一条序列的基础上进行化学修饰、化学标记或碱基的改变。

本发明涉及的六条核酸适配体是以人乳腺癌细胞株SK-BR-3为靶细胞，人乳腺癌细胞株MDA-MD-231、MCF-7和人正常乳腺上皮细胞株MCF-10A为对照细胞，经过连续21轮筛选得到。该核酸适配体具有分子量小、稳定性好、易修饰、无免疫原性的优点，可用于人乳腺癌检测、诊断和分子分型相关试剂盒以及人乳腺癌相关治疗性药物或者制剂的研制。所述的核酸适配体包括以下核苷酸序列中任意一条序列所示的DNA片段：

序列1：

5'-AGCAGAGTTCACGACCCGATAAGGGGAAAACACATTTCGGATCTCCGTTGTCGCCCTGATACCGAGTTACATACCAATCGTCGCAG-3'

序列2：

5'-AGCAGAGTTCACGACCCGATAAGGGCGATGCCGATCCCTGTGGCCGTAGGGACAGTCCCGCTAGAGTTACATACCAATCGTCGCAG-3'

序列3：

5'-AGCAGAGTTCACGACCCGATAAGGGGAAAACACATTTCGGATCTCCGTTGTCGCCCTGGTACCGAGTTACATACCAATCGTCGCAG-3'

序列4：

5'-AGCAGAGTTCACGACCCGATAAGGGGAAAATACATTTCGGATCTCCGTTGTCGCCCTGATACCGAGTTACATACCAATCGTCGCAG-3'

序列5：

5'-AGCAGAGTTCACGACCCGATAAGGGGAAAATACATTTCGGATCTCCGTTGTCGCCCTGGTACCGAGTTACATACCAATCGTCGCAG-3'

序列6：

5'-AGCAGAGTTCACGACCCGATAAGGGCGATGCCGATCCCTGTGGCCGTAGGGGCAGTCCCGCTAGAGTTACATACCAATCGTCGCAG-3'

其中，其核苷酸序列可在任意位置进行化学修饰或改变，包括氨基化、羧基化、巯基化或同位素化中的一种或几种。

其中，其核苷酸序列可在任意位置进行化学标记，包括生物素、亲和素、荧光物质或酶、纳米材料和任何治疗性物质中的一种或几种。

其中，所述核酸适配体的核苷酸序列与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6中的任意一条序列的同源性在60％以上；其核苷酸序列可在SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6中基础上截取部分活性片段或者增加部分序列；其核苷酸序列可在其基础上进行一个或几个核苷酸的替换，并保留其活性。

一种用于检测和诊断人乳腺癌的试剂盒，包含所述的核酸适配体。

一种分子探针，包含权利要求1～5任一项所述的核酸适配体。

上述的核酸适配体设计和制备检测、诊断和治疗人乳腺癌制剂中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明所涉及的核酸适配体具有特异性强，亲和性高，分子量小、稳定性好、制备简单、成本低、易修饰、无免疫原性的优点，并可实现快速的分子诊断。本发明中的各条适配体均能在15min内与靶细胞SK-BR-3稳定结合，而不与其对照细胞：人乳腺癌细胞株MDA-MD-231、MCF-7和人正常乳腺上皮细胞株MCF-10A结合。通过适当的修饰或者标记，可用于人乳腺癌的快速检测和诊断。同时，由于所选择的靶细胞和对照细胞株分别代表了人乳腺癌的三种不同亚型和人正常乳腺组织，因此，该适配体不仅能够区别乳腺癌组织和正常组织还能够很好的区分乳腺癌组织的不同分子亚型，可用于人乳腺癌的临床分子分型。此外，该核酸适配体其本身还可以作为药物或者药物载体，通过包封相应的药物或者治疗制剂可以实现人乳腺癌的靶向治疗。本发明对人乳腺癌的临床检测、诊断和治疗都具有非常重要的意义。

附图说明：

图1为本发明实施例2中利用DNAMAN软件模拟的六条DNA核酸适配体的二级结构示意图；

图2为本发明实施例2中六条核酸适配体与靶细胞SK-BR-3以及三种对照细胞MCF-7，MDA-MB-231和MCF-10A的激光显微共聚焦显微图像；

图3为本发明实施例2中六条核酸适配体与靶细胞SK-BR-3和三种对照细胞MCF-7，MDA-MB-231和MCF-10A结合的流式结果对比图；

图4为本发明实施例2中采用流式细胞仪测定序列1～6核酸适配体与靶细胞SK-BR-3结合的解离常数绘制的曲线图；

图5为本发明实施例3中载阿霉素序列6核酸适配体对不同人乳腺癌细胞株的靶向抑制作用结果。

图6为本发明实施例4中金纳米棒修饰的序列6核酸适配体对不同人乳腺癌细胞株的靶向热疗作用结果。

具体实施方式：

提供以下实施例以便更好地理解本发明，而非限制于本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用材料和试剂如无特殊说明均为实验室常规材料和试剂，均可从市场上购买。

以下实施例中的单链DNA随机文库，引物序列和后续的核酸适配体序列均由生工生物(上海)有限公司合成。

细胞来源：以下实施例中所用的细胞株SK-BR-3，MDA-MB-231，MCF-7和MCF-10A均购自美国ATCC细胞库。

细胞培养基：以下实施例中所用的1640不完全培养基，DMEM不完全培养基和血清均够自Gibco公司，MEGM购自Lonza公司。

其它试剂：霍乱毒素购自Sigma公司，阿霉素购自生工生物(上海)有限公司。结合液：4.5g/L葡萄糖，5mM氯化镁，1mg/mL BSA，0.1mg/mL酵母tRNA，溶于1*PBS溶液当中。清洗液：4.5g/L葡萄糖，5mM氯化镁，溶于1*PBS溶液当中。

实施例1：人乳腺癌细胞株SK-BR-3特异性核酸适配体的筛选

1.设计与合成以下单链DNA文库和引物序列：

随机文库：(N40代表的是有40个随机碱基)

5'-AGCAGAGTTCACGACCCGATAAG-N40-GAGTTACATACCAATCGTCGCAG-3'

上游引物：5'-FAM-AGCAGAGTTCACGACCCGATAAG-3'

下游引物：5'-biotin-CTGCGACGATTGGTATGTAACTC-3'

2.通过Cell-SELEX获得人乳腺癌细胞株SK-BR-3特异性核酸适配子：

2.1细胞培养：采用1640不完全培养基加10％胎牛血清培养人乳腺癌细胞株SK-BR-3和MCF-7；DMEN加10％胎牛血清培养人乳腺癌细胞株MDA-MB-231；MEGM加100ng/ml的霍乱毒素培养人正常乳腺上皮细胞株MCF-10A。所有细胞均在37℃，5％CO₂条件下培养。

2.2筛选前细胞预处理：培养SK-BR-3细胞生长至铺满大于培养皿底90％，吸弃所有培养液，用5ml 4℃预冷的清洗液清洗三遍。

2.3随机文库与靶细胞孵育：将10nmol合成好的随机单链DNA文库低速离心后加入纯水溶解，95℃变性5min后，立即冰浴10min，然后加入等体积的2×结合液中，充分混匀后加入到用清洗液清洗好的细胞培养皿中，于4℃摇床上轻摇孵育60min。

2.4核酸适配体与细胞解离：随机文库与细胞孵育好后，吸弃所有结合液，用37℃预热的清洗液3～5ml于37℃摇床上轻摇清洗3～5遍。然后向培养皿中加入500μl TE缓冲溶液，用细胞刮刀刮取收集所有细胞至1.5ml离心管中，震荡混匀后，沸水浴煮沸10min，然后立即15000rpm离心5min，吸取上清。

2.5核酸适配体次级文库的扩增：取2.4中经适当浓缩后的上清100μl作为PCR反应的模板，进行普通PCR扩增。PCR反应体系如下：

PCR反应的基本条件为：95℃5min，95℃30sec，64℃30sec，72℃30sec，72℃5min。

2.6DNA单链的制备：取链酶亲和素磁珠(MNPs@SA)500μl，0.5×SSC清洗三遍，然后将2.5中PCR反应产物加入到MNPs@SA中震荡孵育30min，磁分离，弃上清，0.5×SSC清洗两遍，纯水清洗一遍。向其中加入50μl 0.2M NaOH溶液变性5min，磁分离取上清，用0.2M HCl溶液中和至pH 7.0。此即为次级文库。

2.7重复筛选：以2.6得到的次级文库重复上述2.2、2.3、2.4、2.5和2.6各两次。

2.8阴性筛选：分别以人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7和人正常乳腺上皮细胞株MCF-10A为对照细胞，用步骤2.7筛选得到的次级文库进行反筛，具体步骤如下：培养MDA-MB-231、MCF-7和MCF-10A细胞至铺满细胞培养皿的90％以上，4℃预冷清洗液清洗3遍，向其中一种对照细胞中加入待筛次级文库和结合液，4℃轻摇孵育后，取上清加入到第二种对照细胞中4℃轻摇孵育后再次取上清加到第三种对照细胞中，4℃轻摇孵育。最后取上清加入到靶细胞SK-BR-3中，4℃轻摇孵育。重复2.4、2.5和2.6。

2.9多轮筛选：用步骤2.8得到的次级文库进行多轮筛选，依次重复2.8、2.4、2.5和2.6。多轮筛选过程中，采用流式细胞仪监测核酸适配体次级文库的富集情况，经过21轮连续筛选后，文库富集度达到饱和。以第21轮筛选得到的核酸适配体为模板，PCR扩增后进行克隆测序分析，最终得到本实例中的六条人乳腺癌细胞株SK-BR-3特异性核酸适配体。

实施例2：六条核酸适配体二级结构、特异性、亲和性和解离常数的考察

一种人乳腺癌细胞株SK-BR-3特异性核酸适配体，该实施例中核酸适配体主要包括以下5'端FAM修饰的六条核苷酸序列中任意一条DNA序列：

序列1：

5'-FAM-AGCAGAGTTCACGACCCGATAAGGGGAAAACACATTTCGGATCTCCGTTGTCGCCCTGATACCGAGTTACATACCAATCGTCGCAG-3'

序列2：

5'-FAM-AGCAGAGTTCACGACCCGATAAGGGCGATGCCGATCCCTGTGGCCGTAGGGACAGTCCCGCTAGAGTTACATACCAATCGTCGCAG-3'

序列3：

5'-FAM-AGCAGAGTTCACGACCCGATAAGGGGAAAACACATTTCGGATCTCCGTTGTCGCCCTGGTACCGAGTTACATACCAATCGTCGCAG-3'

序列4：

5'-FAM-AGCAGAGTTCACGACCCGATAAGGGGAAAATACATTTCGGATCTCCGTTGTCGCCCTGATACCGAGTTACATACCAATCGTCGCAG-3'

序列5：

5'-FAM-AGCAGAGTTCACGACCCGATAAGGGGAAAATACATTTCGGATCTCCGTTGTCGCCCTGGTACCGAGTTACATACCAATCGTCGCAG-3'

序列6：

5'-FAM-AGCAGAGTTCACGACCCGATAAGGGCGATGCCGATCCCTGTGGCCGTAGGGGCAGTCCCGCTAGAGTTA CATACCAATCGTCGCAG-3'

上述可特异性识别和结合人乳腺癌细胞株SK-BR-3的核酸适配体，其核苷酸序列可在其基础上截取部分活性片段或者增加部分序列且与以上序列同源性在60％以上。

上述各核酸适配体，其核苷酸序列可在其基础上进行一个或几个核苷酸的替换，并保留其活性。

上述各核酸适配体，其核苷酸序列可在任一位置进行化学修饰或改变，包括氨基化、羧基化、巯基化和同位素化。

上述各核酸适配体，其核苷酸序列可在任一位置进行化学标记，包括生物素、亲和素、荧光物质、酶、纳米材料和任何治疗性物质。

1.用DNAMAN软件对以上六条核酸适配体进行二级结构模拟预测。DNAMAN软件对六条核酸适配体二级结构模拟的结构示意图，如图1所示。

2.激光扫描共聚焦显微镜考察六条核酸适配体与SK-BR-3细胞的结合效果及其特异性。

在激光扫描共聚焦培养皿中分别培养人乳腺癌细胞株SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231和人正常乳腺上皮细胞株MCF-10A。培养24h后，吸尽培养皿中的培养基，4℃预冷的清洗液清洗三遍，然后将含250nM上述核酸适配体的结合液与上述4种细胞在4℃恒温条件下轻摇孵育15min。孵育好后，吸尽培养皿中的所有液体，用清洗液清洗三遍，最后加入300μl清洗液用于检测，结果如图2所示。激光扫描共聚焦显微镜检测结果表明：以上各核酸适配体均能与人乳腺癌细胞株SK-BR-3特异性结合，而均不能与对照细胞株MCF-7、MDA-MB-231和MCF-10A结合。

3.流式细胞仪检测六条核酸适配体对靶细胞SK-BR-3的特异性。

将处于对数生长期的人乳腺癌细胞株SK-BR-3用无酶消化液消化吹打成单个细胞悬液，1000rpm离心5min后去上清，用5ml 4℃预冷的清洗液，反复吹打清洗两次，每次都1000rpm离心5min后，去上清。然后加入含250nM核酸适配体的结合液200μl，4℃恒温摇床上轻摇孵育15min，1000rpm离心5min，去上清，加入1ml 37℃预热的清洗液清洗三遍。最后1000rpm离心5min后，去上清，再加入300μl清洗液用于流式细胞仪检测。六条核酸适配体与靶细胞SK-BR-3以及三种对照细胞MCF-7、MDA-MB-231和MCF-10A的流式细胞仪检测结果如图3所示，六条核酸适配体均能与靶细胞SK-BR-3稳定结合，而不能与其他三种对照细胞有效结合，说明本实例中的六条核酸适配体都具有较强的特异性。

4.流式细胞仪检测六条核酸适配体与靶细胞SK-BR-3的亲和性及解离常数的测定。

流式细胞仪检测六条核酸适配体与靶细胞SK-BR-3的亲和性及解离常数的测定，具体操作与流式细胞仪检测核酸适配体与靶细胞结合特异性的操作相同。将合成上述六条核酸适配体分别平行配置成不同浓度，分别与等量的靶细胞进行孵育，测定不同核酸适配体浓度下靶细胞的荧光强度。以核酸适配体的浓度为横坐标，相应的荧光强度值为纵坐标，按照公式Y＝B_max*X/(Kd+X)拟合曲线，得到六条核酸适配体的解离曲线。各条核酸适配体的解离曲线如图4所示。由以上六条解离曲线得到各条核酸适配体的解离常数Kd大小如表1所示。结果表明：本实例中的六条核酸适配体对靶细胞SK-BR-3均具有很强的结合能力。

表1：六条核酸适配体的解离常数

实施例3：载阿霉素核酸适配体对人乳腺癌细胞株SK-BR-3的靶向抑制作用

本实施例以序列6核酸适配体为例，测定载阿霉素核酸适配体对人乳腺癌细胞株SK-BR-3的靶向抑制作用。首先，在96孔细胞培养板中分别接种SK-BR-3、MDA-MB-231、MCF-7和MCF-10A四种细胞。每种细胞分为A、B、C三组，A组为阴性对照组，B组为加阿霉素组，C组为加载阿霉素核酸适配体组。以上四种细胞每种、每组、每孔各接种10000个细胞，每组细胞均做六个重复孔，在37℃恒温培养箱中培养24小时。然后去掉培养基，向A组各培养孔中加入100μl完全培养基，B组加入100μl完全培养基溶解的1μM的阿霉素，C组加入100μl完全培养基溶解的1μM载阿霉素核酸适配体，37℃孵育1h后，去掉各孔培养基，用PBS清洗三遍，然后每孔加入100μl完全培养基，继续培养24h。每孔加入MTT 50μl，37℃孵育4个小时，小心去掉所有培养基，向每孔加入150μl DMSO，在脱色摇床上轻摇10min，用酶标仪测定各孔在490nm波长处的吸收值。然后以各细胞种类为横坐标，细胞相对活力为纵坐标作图。如图5所示：游离阿霉素处理组的细胞株SK-BR-3，MCF-7，MDA-MB-231和MCF-10A的细胞相对存活率分别为26.06％，29.10％，20.60％和31.01％。载阿霉素核酸适配体处理组以上四种细胞株SK-BR-3，MCF-7，MDA-MB-231和MCF-10A的细胞相对存活率分别为40.07％，96.66％，94.83％和98.43％。结果表明该核酸适配体对靶细胞SK-BR-3的抑制作用较强，而对其它三种对照细胞抑制作用不明显。表明该核酸适配体具有较强的药物靶向作用，对实现相应乳腺癌亚型的靶向治疗具有重要价值。

实施例4：金纳米棒修饰的核酸适配体对人乳腺癌细胞株SK-BR-3的靶向热疗作用考察

以金纳米棒修饰的序列6核酸适配体为例，考察其对人乳腺癌细胞株SK-BR-3的靶向热疗作用。于96孔细胞培养板中分别接种SK-BR-3、MDA-MB-231、MCF-7和MCF-10A四种细胞。每种细胞分为A、B、C三组，A组为阴性对照组，B组为加金纳米棒组，C组为加金纳米棒修饰的核酸适配体组。以上四种细胞每种、每组、每孔各接种10000个细胞，每组细胞均做六个重复孔，在37℃恒温培养箱中培养24小时。然后去掉培养基，向A组各培养孔中加入100μl完全培养基，B组加入100μl完全培养基分散的100μg/ml的金纳米棒溶液，C组加入100μl完全培养基分散的100μg/ml的金纳米棒修饰的核酸适配体溶液，37℃孵育15min，去掉各孔培养基，用PBS清洗三遍，然后每孔加入100μl完全培养基，采用6W/cm²，808nm的近红外激光连续照射5min，37℃继续孵育24h。每孔加入MTT 50μl，37℃孵育4个小时，小心去掉所有培养基，向每孔加入150μl DMSO，在脱色摇床上轻摇10min，用酶标仪测定各孔在490nm波长处的吸收值。然后以各细胞种类为横坐标，细胞相对活力为纵坐标作图。如图6所示，金纳米棒处理组中四种细胞株细胞株SK-BR-3，MCF-7，MDA-MB-231和MCF-10A的细胞相对存活率分别为93.56％，94.98％，86.67％，92.79％。金纳米棒修饰的核酸适配体处理组四种细胞株细胞株SK-BR-3，MCF-7，MDA-MB-231和MCF-10A的细胞相对存活率分别为56.87％，91.69％，89.78％，94.43％。结果表明，金纳米棒修饰的核酸适配体处理组只对靶细胞的热疗作用较佳，对其它三种细胞作用不明显。该核酸适配体具有较强的特异性，在人乳腺癌的靶向治疗方面，表现出极大的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。