一种IgE特异性核酸适配子、其应用及适配子药物的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体的说涉及一种ige特异性核酸适配子及其在治疗变态反应方面的应用。

背景技术：

由于社会工业化进程加快，环境污染日益严重，变态反应的患病率在全球范围内呈现逐年增高的趋势，影响着世界25%人口的身体健康。变态反应性疾病一般持久而且难以治愈，对患者的身心和经济都产生严重影响，也使生活质量和工作效率降低，已成为突出的全球性健康问题，引起了科学家和医药卫生工作者的广泛关注。目前，治疗变态反应疾病的药物多为皮质类固醇激素、抗组胺药、抗白三烯药物、抗细胞因子药物、神经肽类药物，这些药物大多通过减少或者抑制免疫细胞活化后的炎症基因表达或炎性介质释放发挥作用，不能从根本上抑制变态反应的发生，而且复发率高。因此，寻找新型药物迫在眉睫。

对于变态反应性疾病而言，ige与其受体(fcεri)的结合是触发变态反应的关键环节，而ige-fc片段的cε3-cε4区是与受体结合的主要部位。因此，抑制ige与其受体结合，切断ige/fcεri信号传递，可以达到抑制变态反应的目的，这也成为变态反应性疾病治疗的新思路。基于此，omalizumab，一种抗ige单克隆抗体药物于2003年成功上市，该药可以从根本上阻断ige与效应细胞的结合，进而阻断i型变态反应，取得了满意的临床效果。这为变态反应治疗找到了新的出路，证实了ige靶点药物设计的可行性。但由于抗体制备存在周期长、批次间差异大、不易保存等问题，被称为抗体替代品的适配子(aptamer)成为科研人员新的关注点。2004年，第一个适配子药物--macugen(治疗amd，年龄相关性黄斑变性)由美国fda批准上市，并取得了良好的治疗效果，这树立了适配子替代抗体等药物研发的里程碑。随后，针对各种疾病的适配子药物相继进入实验室和临床研究阶段，将适配子药物研究推向新的高潮。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种成本更低、治疗效果更好的可用于治疗变态反应性疾病的适配子及药物，以克服现有适配子特异性差、生产成本高的问题。

本发明的目的是按照如下技术方案实现的：

首先，本发明提供了一种ige特异性核酸适配子，该适配子具有如seqidno：1所示的核苷酸序列或为在由seqidno：1所示的核苷酸序列基础上进行修饰所形成的核苷酸序列，如seqidno：1所示的核苷酸序列的适配子的核苷酸序列为被命名为g39-a1-29c，其核苷酸序列具体为：5’-ggggtcttgtctttaacccc-3’。

进一步的，在由seqidno：1所示的核苷酸序列基础上进行修饰所形成的核苷酸序列可以是在由seqidno：1所示的核苷酸序列所形成的茎环二级结构的环区发生a碱基取代、c碱基取代或t碱基取代时所形成的核苷酸序列。

其次，本发明提供了所述ige特异性核酸适配子的应用，具体的是所述适配子用于治疗变态反应性疾病，特别是用于治疗ⅰ型变态反应。

再次，本发明提供了含有所述ige特异性核酸适配子的适配子药物，所述适配子药物为针剂或注射剂。所述针剂或注射剂按照现有适配子药物常规制备方法制备。

本发明所获得的适配子在保证了高亲和性的前提下，大大缩短了原a1适配子的核苷酸长度，所获得的适配子且特异性很高，可以更好的发挥生物学效应，利于提高后期适配子修饰的针对性，且由于核苷酸长度更短便于合成，节约成本，为后续该适配子药物研发奠定基础。

附图说明

图1是a1突变适配子的结合率。

图2是增加富g序列的适配子结合率。

图3加入互补序列后的a450。

图4是对g39-a1-29c环上的各个碱基位点进行了点突变操作所得各适配子及各适配子的结合率。

图5是β-氨基己糖苷酶释放率。

图6是dnp-ige不同剂量的致敏作用结果。

图7是大鼠背pca治疗实验结果。

图8是g39-a1-29c对背部pca治疗结果。

图9是大鼠耳廓pca治疗实验结果。

图10是大鼠耳廓兰斑od610。

图11是大鼠耳廓厚度及g39-a1-29c的肿胀抑制率。

图12是对先导分子a1适配子的二级结构预测结果。

图13是目的适配子g39-a1-29c的二级结构预测结果。

具体实施方式

实施例1ige特异性核酸适配子的获得

本发明以80bp的a1适配子作为先导分子，在其基础上进行优化，得到核苷酸序列如seqidno：1所示的目的适配子。

首先，本发明中，作为先导分子的a1适配子的核苷酸序列为：

5'-accgaccgtgctggactctg-ccccgctgccttgcatctgtcttgtctttaatggtatcca-cagtatgagcgagcgttgcg-3'，其中下划线部分的序列为固定序列，利用mfold软件对其二级结构进行预测所得结构见图12。

获得核苷酸序列如seqidno：1的目的适配子的过程是：

1、根据a1适配子二级结构，选择性的删除a1适配子中的部分序列，所要保留核酸序列由上海生工生物技术有限公司合成，新合成的保留核苷酸序列再检测其结合效率，判断其亲和力，再根据各截短变异适配子结合效率的高低，逐步缩短序列，直至得到的适配子亲和靶蛋白cε3-cε4的效率相对最高、序列相对最短为止；

在该步骤，获得一系列a1突变体适配子，各a1突变体适配子的核苷酸序列及结合率数据结果见表1及图1。

表1：a1突变体适配子的结合率

2、将a1适配子通过缺失法得到的序列39-a1-20(tcttgtctttaatggtatcca)的两端分别加上gggg、cccc序列，形成新的突变体适配子g39-a1-20c，结合率为83±2%，g39-a1-20c与39-a1-20(33±4%)相比，其结合率上升显著（图2），所以4个g-c相连的碱基对可显著提高适配子与靶蛋白的亲和绑定。

然后对g39-a1-20c序列进行精简，合成能保证茎环结构的最短序列g39-a1-29c，其结合率为84±4%，结合能力与g39-a1-20c相近甚至略有提高，该序列即为本发明所要求保护的核苷酸序列，其二级预测结构见图13。

如果破坏连续的g-c配对，去掉cccc序列，合成适配子g39-a1-29，测定结合率为79±3%，结合率有明显降低(见表2)。

表2：

3、对获得的g39-a1-29c适配子进行点突变，获得一系列点突变适配子，所得各点突变适配子及相应结合率数据结果见图4。由图4可见，除环区g碱基突变外，g39-a1-29c茎环二级结构的环区大多数碱基的点突变没有引起严重的结合率降低。

结合域的确定：

合成高亲和力突变体适配子的互补序列(见表3)，将互补序列与对应的生物素标记的适配子按照1:1混匀，于沸水浴中加热变性5min，并迅速置于冰水浴中冷却退火10min，形成双链结构，低温备用，利用竞争elisa法测定结合率，结果如图3。可以看出，加入互补序列c[23-a1-9]、c[39-a1-20]、c[39-a1-29]、c[57-a1-17]后，a450变化显著，可知，23-a1-9、39-a1-20、39-a1-29中的tcttgtctttaa序列结构对亲和绑定贡献重大，从而确定tcttgtctttaa序列是其结合域。

表3：

本例中对适配子结合率的测定采用竞争elisa法，其具体步骤是：

本例中，选择使用在早期筛选中明确与ige亲和力极低的a8适配子作为阴性对照的无关适配子，其核苷酸序列为：

5'-accgaccgtgctggactctg-gttctgtgctctcctgttgggccgtgtccctgctgttgtt-cagtatgagcgagcgttgcg-3'，其中斜体字下划线部分的序列为固定序列。

具体操作过程是：取0.15μg/μl的cε3-cε4蛋白100μl与包被缓冲液100μl混匀后包被于可拆卸酶标板，设置bsa阴性对照孔，pbs空白对照孔，4℃过夜。次日，弃去液体，300μl洗涤缓冲液于微量振荡器上洗板1min，甩干，重复洗涤三次。每孔加入封闭液300μl，并于37℃封闭2h。同时将不对称pcr得到的生物素标记的适配子100μl(2μmol/l)沸水浴加热变性5min后，立即置于冰水混合浴中10min，而后与200μmol/l突变适配子1μl混匀，低温备用(互补序列法得到的突变体操作略有不同，其是将互补序列与生物素标记的适配子按照1:1混匀，于沸水浴中加热变性5min，并迅速置于冰水浴中冷却退火10min，形成双链结构，低温备用)。弃去酶标板各孔封闭液，洗板三次，每孔加入100μl上述混匀的备用液，记为突变孔。同时设置阳性对照孔(只含生物素标记的适配子)、无关对照孔(无关适配子a8)、空白对照孔(只包被靶蛋白，不加入适配子)，每种处理设置三个复孔，37℃共孵育1h。洗板3次，每孔加入100μlhrp-streptavidin，37℃孵育1h。洗板三次，每孔加入100μltmb底物液，室温，避光显色20min后，每孔加入50μl终止液。于提前预热好的酶标仪测定a450值，记录分析数据。

结合率=(阳性对照孔a450-突变孔a450)/(阳性对照孔a450-空白对照孔a450)×100%。

实施例2细胞水平验证试验

dmem与fbs按9:1(v:v)混合，培养rbl-2h3细胞，37℃，5%co2培养箱中培养，视细胞生长情况换液、消化，待生长稳定后，收集对数期细胞。取对数生长期细胞，调整浓度为2×10⁵个/ml，以1ml/孔的量接种于24孔板中，置培养箱中37℃、5%co2条件下培养12h后，吸弃培养液，用pbs洗涤3次，每孔加1mlpbs置培养箱中稳定10min后加药，每孔加入dmem、fbs、终浓度0.1μg/ml的dnp-ige及作为治疗剂的不同终浓度(1、10、100μmol/l)的g39-a1-29c适配子共1ml，同时设置不加治疗剂的阳性对照组，加入无关适配子a8的阴性对照组，及不加药物的空白对照孔，各设置三个复孔，23培养箱中培养12h，pbs洗涤3次，每孔加入终浓度10μg/ml的dnp-bsa，于培养箱中激发1h，备用。

β-氨基己糖苷酶是肥大细胞脱颗粒的重要标志。肥大细胞被激活后释放的β-氨基己糖苷酶在酸性条件下可将底物(4-硝基苯基-n-乙酰-β-d-氨基半乳糖苷)水解，终止液(碳酸钠缓冲液，ph10.7)可使降解产物显黄色，通过测定吸光度值a405，反映出β-氨基己糖苷酶的活性，间接反映出肥大细胞脱颗粒的程度。

离心收集处理好备用的细胞上清，同时将空白孔用0.1%的tritonx-100裂解，取细胞裂解液上清记为总酶孔上清液，用于测定总β-氨基己糖苷酶活性，设置三个复孔。另取酶标板每孔加入4mmol/l底物50μl，37℃孵育2min，然后取各孔上清50μl于各含50μl底物的酶标孔中，同时设置空白对照孔，37℃温育1h。各孔加入200μl的0.1mol/l的na2co3/nahco3(ph10.7)缓冲液终止反应。酶标仪测定a405值，计算β-氨基己糖苷酶释放率(%)：

β-氨基己糖苷酶释放率(%)=(实验组上清od值-空白孔上清od值)/(总酶孔od值-空白孔上清od值)*100%。

结果：

β-氨基己糖苷酶活性的高低与其浓度呈现正相关，而其浓度的高低与肥大细胞脱颗粒程度显著相关，因此，我们可以通过测定β-氨基己糖苷酶活性来评价肥大细胞脱颗粒程度。加入适配子g39-a1-29c治疗的实验组其β-氨基己糖苷酶的释放量受到抑制，因此体现出g39-a1-29c对肥大细胞脱颗粒的治疗作用。图5是β-氨基己糖苷酶释放率的结果，可以看出g39-a1-29c适配子起到显著的治疗作用，并且治疗作用呈浓度依赖性。

实施例3动物水平验证试验

1、大鼠背部被动皮肤过敏反应(pca)实验：

大鼠20只，雌雄随机，平均分为两组，用乙醚麻醉，第一组为dnp-ige剂量优化实验组，背部沿中线两侧分别皮内注射致敏剂dnp-ige50ng、100ng、200ng记为低、中、高剂量点，注射生理盐水作为空白对照点，4h后尾静脉注射1mg/mldnp-bsa100μl与1%伊文斯兰300μl的混合液，30min后麻醉处死，剪下背部皮肤，测量皮肤内侧蓝斑直径，沿蓝斑轮廓剪下蓝斑，剪碎，置于1mlna2so4与丙酮的混合液中(3:7)，37℃，浸泡24h，离心吸取上清，测定610nm处的光密度值，比较各点间差异，统计分析。第二组为实验组，于得到最优dnp-ige的致敏剂量后，进行第二组的适配子治疗实验，操作同上，皮内注射的各实验点分别为生理盐水（空白对照），dnp-ige与高、中、低浓度(5、2.5、0.5μmol/l)适配子g39-a1-29c治疗组，无关适配子a8组(无关对照)，dnp-ige组(阳性对照)。其余操作同上。统计分析od610。

结果：

①、dnp-ige剂量优化实验结果：

大鼠致敏后，肥大细胞的细胞膜稳定性降低，通透性增加，尾静脉注射混有伊文斯兰染料的抗原激发后，染料就会从过敏组织中渗出，在大鼠背部皮肤上形成蓝斑，蓝斑的直径和od610值与大鼠的致敏程度呈直接相关，因此通过测量蓝斑和od610值来探究试剂的致敏作用或治疗作用。dnp-ige不同剂量的致敏作用结果见图6，a-d点分别为dnp-ige的低、中、高剂量点和生理盐水的阴性对照点。随着dnp-ige注射剂量的增加，蓝斑直径和蓝斑提取液的光密度值逐渐增加，100ng注射剂量时，od610(0.576±0.014)，显著高于50ng的低剂量组(0.311±0.029)。因此采用dnp-ige的致敏剂量为100ng进行后续实验。

②、大鼠背pca实验结果

利用适配子g39-a1-29c对大鼠进行治疗，a点为生理盐水空白对照组，b-d各点分别为g39-a1-29c高(5μmol/l)、中(2.5μmol/l)、低(0.5μmol/l)剂量组，e组为无关适配子a8对照组，f组为dnp-ige(100ng)阳性对照组。其大鼠pca结果如图7所示，高剂量的g39-a1-29c起到明显的治疗作用。蓝斑直径和od610值见图8，可见od610值随着g39-a1-29c浓度的增大而减小，可知g39-a1-29c对过敏反应的治疗作用呈浓度依赖性，而且治疗效果显著。

2、大鼠耳廓肿胀及耳pca实验

随机取大鼠30只，平均分成5组，第一组，为阴性对照组，将每只大鼠的左耳皮下注射生理盐水50μl；第二组、第三组、第四组，分别为高、中、低剂量治疗组，分别将每组大鼠的左耳皮下注射1×10-3μg/μl的dnp-ige与终浓度分别为5μmol/l、2.5μmol/l、0.5μmol/l的适配子g39-a1-29c共计50μl；第五组为适配子a8的无关对照组，将每只大鼠的左耳皮下注射1×10-3μg/μl的dnp-ige与终浓度为5μmol/l的适配子a8共计50μl。每组大鼠的右耳皮下注射1×10-3μg/μl的dnp-ige50μl，每组大鼠的右耳为阳性对照组。4h后尾静脉激发，麻醉处死，观察大鼠两耳蓝斑大小及颜色深浅，并打孔器打孔测量其厚度，浸泡提取蓝色染料，测定od610值，统计分析。

肿胀抑制率=(右耳厚度-左耳厚度)/右耳厚度*100%。

结果：

图9是大鼠耳廓的伊文斯兰渗出结果，a-f分别为空白对照组、g39-a1-29c高、中、低剂量组、无关适配子组、阳性对照组。可以看出随着g39-a1-29c剂量降低，蓝斑逐渐增大，而且g39-a1-29c治疗组与阳性对照组相比有明显的抑制作用，经过浸泡提取蓝色素测得的od610值(图10)和耳片厚度、抑制率(图11)，更加证实了上述结论。

本实验中对rbl-2h3细胞进行中性红染色来测定其脱颗粒程度、测定胞浆内ca²⁺浓度，胞外β-氨基己糖苷酶释放率监测其活化程度。这三个指标测定简便，结果稳定，具有代表性。实验结果表明g39-a1-29c适配子能显著的抑制rbl-2h3细胞的脱颗粒反应，并且呈现浓度依赖性。

本实验还成功构建了大鼠不同部位(背部、耳廓)的pca模型，在动物水平对g39-a1-29c适配子的治疗作用进行验证。结果显示，优化的g39-a1-29c适配子能显著抑制因变态反应所致的毛细管通透性增加，蓝色染料渗出等变态反应症状，且呈浓度依赖性。

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<110>河北大学

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