一种花药特异表达启动子PV4及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术和植物基因工程领域，特别涉及一种花药特异表达启动子pv4及其应用。

背景技术：

启动子是rna聚合酶特异性识别和结合的dna序列，控制基因表达的起始时间、表达程度和表达位置。按其功能，主要分为组成型启动子、诱导型启动子和特异性启动子三大类。组成型启动子表达基因没有时空特异性，在各组织器官均有表达，如玉米ubiqultin启动子、水稻actinl启动子和花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子；诱导型启动子控制的基因，其表达受各种诱导因子，如激素、化学物质、温度和光等的诱导表达；而特异性启动子控制的基因的表达具有器官或组织特异性和时空性，如水稻花器官特异表达启动子osm45、水稻花药特异性启动子osg6b、烟草花药绒毡层特异性启动子ta29等。

植物基因工程操作和转基因方法使外源基因导入植物更为有效，为功能基因组的开展和农作物基因工程育种奠定了基础。常规转基因操作，都需要利用抗生素作为筛选标记，提高转基因植物筛选的效率。由于常规转基因植物，大多保留了抗性筛选基因，这大大增加了人们对转基因植物，特别是转基因食品安全性的忧虑，担心以抗生素为筛选标记的选择标记基因及其产物在食用时会产生毒性或引起过敏反应。尽管并没有确切的证据证实存在这种安全隐患，但这种忧虑严重地阻碍了转基因植物产品的产业化和商业化进程。因此，建立一种简单、高效的无筛选标记的植物重组表达载体系统，对提高转基因植物的安全性，促进其产品的产业化和商业化进程有着十分重要的作用和意义。

无筛选标记转基因植物获得的方法主要有：共转化方法(包括使用双t-dna区载体)、转座子方法、同源重组法和位点特异性重组方法。其中位点特异性重组方法是目前用得最广的方法，其主要是利用重组酶与其特异识别的dna位点，主要包括来源于噬菌体p1的cre/loxp系统、酵母2μ质粒的flp/frt系统和酵母psrl的r/rs系统。其中cre/loxp系统是目前研究与使用最多的成熟系统。利用cre/loxp系统进行标记基因删除(markerfree)操作的策略主要有两类：(1)把cre酶基因表达盒用杂交或再转化的间接方法，导入筛选标记基因含有loxp位点的转基因植物，再通过自交进一步分离去掉重组酶基因及转化重组酶基因所引入的另一个筛选标记，整个过程耗时费力，也不适于无性繁殖植物；(2)表达cre酶，直接切除位于两个同向loxp位点内的筛选标记基因和cre酶基因表达盒本身，相比之下，第二种策略更加简单有效。由于cre重组酶基因在植物中组成型表达会导致植物形态和产量性状的改变。因此，使用器官特异诱导启动子，在特定器官和特定时期调控cre重组酶基因表达，能够实现转基因植物的抗性筛选标记基因和cre酶基因表达盒的自身切除。目前，已有一些利用诱导启动子和器官特异启动子控制cre酶基因的表达，成功实现转基因植物的markerfree操作的报道。如烟草花药绒毡层特异性启动子ta29控制cre的表达来获得markerfree的转基因植物，但是它在单子叶植物中去除标记基因效率不高。因此，寻找和利用新的、更加有效地植物器官特异表达启动子，对于提高转基因植物安全性具有重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种花药特异表达启动子pv4。

本发明的另一目的在于提供上述花药特异表达启动子pv4的应用。

本发明的再一目的在于提供一种无筛选标记转化载体系统，其含有花药特异表达启动子pv4。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种花药特异表达启动子pv4，是具有如下特征的dna分子：其核苷酸序列如seqidno:1所示；或是在严格条件下与seqidno:1限定的dna序列杂交的dna分子；或是与seqidno:1限定的dna序列具有90％以上的相似性，且能调控目的基因在花药中特异表达的dna分子。

该花药特异表达启动子pv4，是水稻villin4基因(loc_os04g51440)的启动子，能启动villin4在水稻花药中特异性表达，其中在成熟期花药中表达最高，而在其它组织器官如根、茎、叶等器官中没有表达。

所述的花药优选为水稻花药。

所述的花药特异表达启动子pv4在构建于花药中特异性表达的基因表达盒或是于花药中特异性表达的表达载体中的应用。

一种于花药中特异性表达的基因表达盒，包含上述花药特异表达启动子pv4。

所述的于花药中特异性表达的基因表达盒，还包括目的表达基因和终止子。

一种于花药中特异性表达的表达载体，包含上述花药特异表达启动子pv4或是上述于花药中特异性表达的基因表达盒。

所述的于花药中特异性表达的表达载体优选为无筛选标记转化载体系统；更优选为含有所述pv4启动子的植物cre/loxp重组表达载体，可在植物中实现筛选标记基因删除。

所述的植物cre/loxp重组表达载体的t-dna区内含有两个同向loxp序列，两个同向1oxp序列之间含有cre重组酶表达盒和标记基因表达盒；cre重组酶表达盒中启动cre重组酶表达的启动子是所述的pv4启动子。

所述的植物cre/loxp重组表达载体还含有多克隆位点或外源目的基因的表达盒；多克隆位点或外源目的基因表达盒位于t-dna区内，在所述两个同向loxp序列区间之外。

所述的植物cre/loxp重组表达载体被转入植物后，能在花药发育过程中将所述两个同向loxp序列之间的cre重组酶表达盒和筛选标记基因表达盒删除，从而去除标记基因和cre基因本身。

所述的植物cre/loxp重组表达载体具体可为如图3所示的9个表达载体，即pyl-pv4mf1、pyl-pv4mf2、pyl-pv4mf3、pyl-pv4mf4、pyl-pv4mf5、pyl-pv4mf6、pyl-pv4mf7、pyl-pv4mf8和pyl-pv4mf9。

所述的植物cre/loxp重组表达载体，可用于转化单子叶植物或双子叶植物，培育无筛选标记的转基因植物。

所述的单子叶植物包括水稻、玉米、小麦、高粱、大麦、燕麦、黑麦等，优选为水稻。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明用含有pv4启动子的植物cre/loxp重组表达载体的转基因实验证明，在转基因植物中，pv4启动子可以控制cre重组酶在花药中的特异表达，而在愈伤组织和根、茎、叶等器官中没有表达。这样可以不影响转基因愈伤细胞的抗性筛选，得到转基因植株和在花药产生删除标记基因的雄配子，最终在转基因植物后代中可筛选到无筛选标记(markerfree)的转基因植物。

附图说明

图1为pv4启动子驱动的水稻villin4基因的qrt-pcr表达模式结果图；其中，用水稻osactin1基因作为表达内参。

图2为pv4启动子中预测的组织特异表达的相关功能元件示意图，其中，小写字母为内含子；下划线加阴影为5’utr区；粗体为重要的花粉特异元件。

图3为含pv4启动子的植物cre/loxp重组表达载体系统图谱图；其中，图(a)是具有多克隆位点的不同植物筛选抗性的cre/loxp重组表达载体示意图，pyl-pv4mf1、2、3的抗性分别是潮霉素hpt、卡拉霉素nptii以及草甘膦bar；图(b)是具有玉米ubi启动子驱动目的基因(待克隆)表达盒的不同植物筛选抗性cre/loxp重组表达载体，pyl-pv4mf4、5、6的抗性基因分别是抗潮霉素基因hpt、抗卡拉霉素基因nptii以及抗草甘膦基因bar；图(c)是具有花椰菜35s启动子驱动目的基因(待克隆)表达盒的不同植物筛选抗性基因-cre/loxp重组表达载体，pyl-pv4mf7、8、9的抗性基因分别是hpt、nptii以及bar。

图4为pyl-pv4mf1转化的t0代植株的hpt基因的pcr检测结果图。

图5为pyl-pv4mf1转化的t0植株#1的cre基因的rt-pcr表达分析结果图。

图6为pv4控制cre/loxp系统的筛选标记删除的模式图；pv4在花药中驱动cre基因表达，在花药中自删除筛选标记基因和cre基因，最终在后代中获得完全无筛选标记的植株。

图7为pyl-pv4mf1的t1代植株以p1、p2和p3为引物的pcr扩增检测筛选标记删除情况结果图。

图8为pyl-pv4mf1的t1代植株发生筛选标记删除的p1/p3pcr产物测序结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规分子生物学方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

表1实施例中各个名称引物对应的核苷酸序列

实施例1

水稻花药特异表达启动子pv4的克隆与分析：

s1.水稻villin4基因的表达模式：在本发明的前期研究中，为分离克隆花药特异表达的启动子，通过对ricexpro芯片(http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/)的分析，发现水稻微丝发育相关的villin4基因(loc_os04g51440)主要在水稻花药中特异高表达。

提取水稻(品种日本晴)愈伤组织、根、茎、叶及不同发育时期花药和雌蕊的总rna反转录成cdna，通过qrt-pcr分析villin4基因的表达(引物为fq-v4/rq-v4)，用水稻osactin1作为内参基因(引物为factin1/ractin1，大小约250bp)，反应程序：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火20s，72℃延伸15s，72℃15s读板，40个循环；55℃至90℃溶解曲线。结果表明，该基因在愈伤、根、茎等组织没有表达，在叶和雌蕊中有微弱表达，主要是在花药发育后期高表达(图1)。因此，villin4基因是一个花药特异表达的基因，其启动子pv4是一个花药特异表达的启动子。

s2.villin4基因的启动子pv4的克隆和顺式元件分析：villin4基因的atg上游区1kb处是另一基因的3’端，因此用引物f1/r1扩增水稻(日本晴)dna，连入t载体puc18后测序，获得villin4基因的启动子pv4(seqidno:1)，即获得t-pv4载体；用启动子顺式元件预测网站place(http://www.dna.affrc.go.jp/place/signalup.html)分析seqidno:1，预测结果显示pv4存在多个器官或组织特异性表达的相关元件，含有多个花粉特异表达元件，进一步表明pv4是一个花药特异表达启动子(图2)。所用pcr扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30sec、58℃退火30sec、72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃再延伸5min。

实施例2

含pv4启动子的植物cre/loxp重组表达载体系统pyl-pv4mf1～9的构建：

s1.pyl-pv4mf1～3重组表达载体的构建：

s1.1.中间载体pyl-mcs的构建：用引物f1300/r1300(引物5’末端分别含psti和pmei位点)反向扩增质粒pcambia1300(cambia公司)，获得含psti和pmei位点、且含t-dna区的载体骨架(去除hpt表达盒)；直接合成含多个唯一酶切位点的psti/fsei/hindiii/saci/asci/swai/sbfi/paci/mlui/pmei多克隆位点片段mcs-i；用psti和pmei双酶切mcs-i，连入载体骨架的相同位点，获得中间载体pyl-mcs。

合成的mcs-i片段序列如下：

5’-aattaactgcagatccaggccggccataagctttgagctctaagcgcgcctatttaaatacctgcaggtttaattaagaacgcgttcagtttaaacttaaatta-3’(下划线分别对应psti/fsei/hindiii/saci/asci/swai/sbfi/paci/mlui/pmei位点)。

s1.2.pyl-pv4mf1的构建：用引物f-p-lox/r-fsei从pcambia1300质粒扩增2.2kb的hpt表达盒，并在两侧加入psti/loxp位点序列和fsei位点，psti和fsei双酶切、连入中间载体pyl-mcs的相同位点，获得中间载体pyl-loxp-hpt；用引物f-p-lox/r-fsei从pcambia2301(cambia公司)质粒扩增约2.0kb的nptii表达盒，psti和fsei双酶切、连入中间载体pyl-mcs的相同位点，获得中间载体pyl-loxp-nptii；用引物f-p-lox/r-fsei从pcambia3301(cambia公司)质粒扩增约1.6kb的bar表达盒，并在两侧加入psti-loxp位点序列和fsei位点，psti和fsei双酶切后连入中间载体pyl-mcs的相同位点，获得中间载体pyl-loxp-bar；

pv4启动cre基因的表达盒拼接：用引物f-pv4-loxp-hindiii/r-pv4从t-pv4载体上扩增1kb左右pv4启动子，获得引入loxp位点的pv4启动子片段a；参考cre酶基因序列(genbankno.dq340306)合成的1.3kbcre基因，用引物f-cre1/r-cre1扩增，作为片段b；用引物f-tnos/r-tnos-fsei从质粒pcambia1305(cambia公司)扩增0.38kb的nos终止子tnos，作为片段c；上述每个片段一侧，分别带有20～25bp的同源序列，利用基于gibson克隆的原理(gibson,2011,enzymaticassemblyofoverlappingdnafragments.methodsenzymol.,498:349-361.)的等温重组反应后的irr-pcr(isothermalrecombinationreaction-basedpcr)方法(具有同源末端的多个小片段，混合后加入gibsonassemblymastermix(neb公司)进行等温重组反应(50℃、30分钟)，再以反应产物作为模板直接进行pcr扩增，体外拼接成完整大片段(chenw,zengd,shenr,max,zhangq,chenl,liuy-g,zhuq.2016,rapidinvitrosplicingofcodingsequencesfromgenomicdnabyisothermalrecombinationreaction-basedpcr.biotechnology&biotechnologicalequipment,30:864-868.)，用引物f-pv4-loxp-hindiii/r-tnos-fsei直接拼接三个片段获得了结构为fsei-cre-loxp-hindiii的表达盒；把含花药特异启动子pv4的cre基因的表达盒(fsei-cre-loxp-hindiii表达盒)直接酶切连接，插入fsei和hindiii酶切的中间载体pyl-loxp-hpt，获得植物筛选标记为hpt的cre/loxp重组表达载体pyl-pv4mf1(图3a)。

s1.3.pyl-pv4mf2的构建：把含花药特异启动子pv4的cre基因的表达盒(fsei-cre-loxp-hindiii表达盒)直接酶切连接，插入fsei和hindiii酶切的中间载体pyl-loxp-nptii，获得植物筛选标记为nptii(卡拉霉素)的cre/loxp重组表达载体pyl-pv4mf2(图3a)。

s1.4.pyl-pv4mf3的构建：把含花药特异启动子pv4的cre基因的表达盒(fsei-cre-loxp-hindiii表达盒)直接酶切连接，插入fsei和hindiii酶切的中间载体pyl-loxp-bar，获得植物筛选标记基因为bar(抗草甘膦)的cre/loxp重组表达载体pyl-pv4mf3(图3a)。

s2.pyl-pv4mf4～6重组表达载体的构建:

s2.1.pyl-pv4mf4的构建：参考玉米ubi启动子序列(genbankno.jx947345)用引物f-ubi-hindiii/r-ubi-saci直接从抽提的玉米叶片dna中pcr扩增获得，ubi启动子两端引物引入hindiii和saci位点，再用hindiii和saci双酶切连入pyl-pv4mf1的相同位点，获得中间载体pyl-pv4mf1-ubi；用引物f-tnos-mlui/r-tnos-pmei从质粒pcambia1305(cambia公司)扩增0.38kb的nos终止子tnos，引入mlui/pmei双酶切位点，再用mlui/pmei双酶切连入中间载体pyl-pv4mf1-ubi的相同位点，最终获得植物筛选标记为hpt，并具有pubi-mcs-tnos表达盒的cre/loxp重组表达载体pyl-pv4mf4载体(图3b)。

s2.2.pyl-pv4mf5的构建：用hindiii和pmei双酶切pyl-pv4mf4载体获得pubi-mcs-tnos表达盒，直接连入相同位点的pyl-pv4mf2载体，获得植物筛选标记为nptii，并具有pubi-mcs-tnos表达盒的cre/loxp重组表达载体pyl-pv4mf5(图3b)。

s2.3.pyl-pv4mf5的构建：用hindiii和pmei双酶切pyl-pv4mf4载体获得pubi-mcs-tnos表达盒，直接连入相同位点的pyl-pv4mf3载体，获得植物筛选标记为bar，并具有pubi-mcs-tnos表达盒的cre/loxp重组表达载体pyl-pv4mf6(图3b)。

s3.pyl-pv4mf7～9重组表达载体的构建：

s3.1.pyl-pv4mf7的构建：用引物f-p35s-hindiii/r-p35s-saci从质粒pcambia1305(cambia公司)直接扩增获得加hindiii和saci位点双位点花椰菜病毒p35s启动子，再用hindiii和saci双酶切连入pyl-pv4mf1的相同位点，获得中间载体pyl-pv4mf1-35s；用引物f-tnos-mlui/r-tnos-pmei从质粒pcambia1305(cambia公司)扩增0.38kb的nos终止子tnos，引入mlui/pmei双酶切位点，再用mlui/pmei双酶切连入中间载体pyl-pv4mf1-35s的相同位点，最终获得植物筛选标记为hpt，并具有p35s-mcs-tnos表达盒的cre/loxp重组表达载体pyl-pv4mf7载体(图3c)。

s3.2.pyl-pv4mf8的构建：用hindiii和pmei双酶切pyl-pv4mf7载体，获得p35s-mcs-tnos表达盒，直接连入相同位点的pyl-pv4mf2，获得植物筛选标记为nptii，并具有p35s-mcs-tnos表达盒的cre/loxp重组表达载体pyl-pv4mf8(图3c)。

s3.3.pyl-pv4mf9的构建：用hindiii和pmei双酶切pyl-pv4mf7载体，获得p35s-mcs-tnos表达盒，直接连入pyl-pv4mf3的相同位点，获得植物筛选标记为bar，并具有p35s-mcs-tnos表达盒的cre/loxp重组表达载体pyl-pv4mf9(图3c)。

实施例3

无筛选标记(markerfree)转基因植株的获得与分析：

s1.含pv4的cre/loxp重组表达载体pyl-pv4mf1的水稻转化与检测

s1.1.水稻的遗传转化：把cre/loxp重组表达载体pyl-pv4mf1质粒转入农杆菌eha105，得到转化有pyl-pv4mf1质粒的农杆菌，用于转化水稻(日本晴)胚愈伤组织。水稻遗传转化方法按照nishimura等(2006)详细报道的方法进行(nishimura,etal.2006,aprotocolforagrobacterium-mediatedtransformationinrice.natprotoc.，1:2796-2802。下同)。将水稻未成熟种子或成熟种子，在25℃黑暗条件下诱导愈伤组织。用适量的pyl-pv4mf1质粒的农杆菌悬浮于加有100μmol/l乙酰丁香酮的侵染液培养基(aam培养基)(nishimura，etal.,2006)中，28℃震荡培养(200rpm，0.5h)，用分光光度计调od550值为0.3～0.4，即可用于愈伤组织的浸染。挑选颜色新鲜呈淡黄色、生长旺盛的颗粒状胚性愈伤组织，和前述调节好od值的农杆菌菌液混合，浸泡20min，吸干菌液后转到共培养培养基(2n6-as培养基)(nishimura，etal.,2006)，暗培养3天后，转移到含50mg/l潮霉素的筛选培养基(n6d-s培养基)(nishimura，etal.,2006)上，每2周继一次代，继代2次。抗性筛选后，把带有绿点的抗性愈伤转到有分化培养基(hiei，etal.,1994)上，分化出转化苗，获得t0转化植株。

s1.2.转化植株基因组pcr检测：对获得的t0代植株叶片，用sds法抽提基因组dna作为模板，用pcr扩增方法，检测外源hpt片段(约330bp)，引物为f-hpt/r-hpt所用扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30sec，58℃褪火30sec，72℃延伸30sec，共30个循环；最后72℃再延伸5min。结果显示，野生型(wt)对照都不能扩出外源基因，转基因植株都能扩出上述hpt片段(图4)。

s1.3.t0代转化体cre基因的rt-pcr表达检测：

利用trizol方法，抽提t0转化体(#1)抗性愈伤组织、分化产生的根、茎、叶以及成熟花药的总rna，用mmv逆转录试剂盒，oligdt引物反转录为cdna，用引物f-rt-cre/r-rt-cre、f-hpt/r-hpt和factin1/ractin1分别进行cre基因(约290bp)、hpt(约330bp)和水稻内源actin1基因(内参，约250bp)的rt-pcr表达检测。所用扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30sec，58℃褪火30sec，72℃延伸30sec，共25个循环；最后72℃再延伸5min。结果显示，pv4驱动cre基因只在花药里表达，在愈伤、根、茎和叶中均无表达(图5)，说明pv4确实是花药特异表达启动子。

s2.转pyl-pv4mf1水稻t1代植株筛选标记删除鉴定

s2.1.pv4控制cre/loxp系统的标记基因删除原理：pv4是花药特异启动子，在转基因的t0转化体中，只在花药中驱动cre基因表达，而在其他器官不表达。在花药中，当cre基因表达时，位于两个同向loxp位点间的hpt基因(标记基因)和cre基因同时被删除，只留下一个loxp位点。由于标记删除发生在t0代植株的雄配子而不发生在雌配子，在t1代植株中，这种筛选标记删除是杂合的；但在下一代(t2)植株中，就能分离获得大量的标记完全删除纯合的转基因植物(图6)。

s2.2.pcr鉴定标记删除的转基因植物：对获得的t1代植株叶片，用sds法抽提基因组dna作为模板，用pcr扩增方法，检测标记基因删除情况。用引物p1、p2、p3同时进行三引物pcr扩增；其中p2位于hpt基因编码区内测，与p1扩增产物约500bp；p1和p3位于两个loxp位点外侧，当没发生删除时距离约5.2kb，在30sec延伸条件下是不能扩增的，而只有当发生删除时，才能扩增出删除hpt/cre后产生的230bp的小片段。所用扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30sec，60℃褪火30sec，72℃延伸30sec，共30个循环；最后72℃再延伸5min。结果显示，t1代植株大多发生了预期的标记删除(图7)。

s2.3.删除小片段pcr产物测序鉴定：对p1/p3扩增的删除hpt/cre后产生的230bp的小片段pcr产物进行直接测序，结果表明该片段与预期的片段序列完全一致(图8)。

上述结果表明，pv4控制的cre/loxp重组表达载体在转基因植物t1代中，就能按预期设计在花药中实现标记基因的删除，在其下一代植株中，就能获得标记删除纯合的转基因植物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>华南农业大学

<120>一种花药特异表达启动子pv4及其应用

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atctggattttagtactgg79

<210>11

<211>45

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-fsei

<400>11

aattaaaggccggccgcggtttgcgtattggctagagcagcttgc45

<210>12

<211>71

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-pv4-loxp-hindiii

<400>12

attaatgagctcaataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatacgcgccgttgca60

gtaggatagag71

<210>13

<211>48

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-pv4

<400>13

gtacggtcagtaaattggacatgcttgatgttgtgaaagagcctttcc48

<210>14

<211>48

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-cre1

<400>14

ggaaaggctctttcacaacatcaagcatgtccaatttactgaccgtac48

<210>15

<211>44

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-cre1

<400>15

ccaaatgtttgaacgatcgggactaatcgccatcttccagcagg44

<210>16

<211>44

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-tnos

<400>16

cctgctggaagatggcgattagtcccgatcgttcaaacatttgg44

<210>17

<211>36

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-tnos-fsei

<400>17

aattaaaaggccggcccccgatctagtaacatagat36

<210>18

<211>39

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-ubi-hindiii

<400>18

aattaaaagctttcgtgcccctctctagagataatgagc39

<210>19

<211>39

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-ubi-saci

<400>19

aattaagagctcgcagaagtaacacctaacaacagggtg39

<210>20

<211>34

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-tnos-mlui

<400>20

aattaaacgcgttcccgatcgttcaaacatttgg34

<210>21

<211>34

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-tnos-pmei

<400>21

aattaagtttaaaccccgatctagtaacatagat34

<210>22

<211>36

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-p35s-hindiii

<400>22

aattaaaagctttcccgccttcagtttagcttcatg36

<210>23

<211>37

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-p35s-saci

<400>23

aattaagagctcgtcaagagtcccccgtgttctctcc37

<210>24

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-hpt

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cggtcattgactggagcgagg21

<210>25

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-hpt

<400>25

ctacacagccatcggtccagac22

<210>26

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-rt-cre

<400>26

cctggaaaatgcttctgtcc20

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<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-rt-cre

<400>27

cagcattgctgtcacttggtcg22

<210>28

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>p1

<400>28

cattactcgcatccattctcag22

<210>29

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>p2

<400>29

cgggactgtcgggcgtacaca21

<210>30

<211>23

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>p3

<400>30

gcttggattctgcgtttgtttcc23

<210>31

<211>104

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>多克隆位点片段mcs-i

<400>31

aattaactgcagatccaggccggccataagctttgagctctaagcgcgcctatttaaata60

cctgcaggtttaattaagaacgcgttcagtttaaacttaaatta104