本发明属于海洋天然产物领域，具体涉及一种由红树尖瓣海莲内生真菌产生的抗弧菌活性化合物及其制备方法。
背景技术：
在过去的半个多世纪里，由于抗生素的广泛使用，特别是不合理的临床误用,造成耐药性致病菌种类的不断增加,对人类生命健康带来极大威胁。为了减少细菌耐药性的产生，急需开发新的高敏抗菌药物，以提高临床用药的有效性。
海洋高盐、高压、低光照等条件使海洋微生物能够产生大量结构新颖、活性独特的次级代谢产物，其中许多化合物具有抗菌活性，为寻找潜在的抗菌药物先导化合物提供了重要来源。
近年来，随着海洋天然药物化学的发展，越来越多的抗菌活性化合物从海洋微生物中不断分离获得，为寻找新型抗菌剂提供了物质基础。采用人工培养发酵的方法，从海洋微生物中获得有重要抗菌活性的次级代谢产物，具有环境友好、可持续发展等特点，能有效解决药物开发过程中的药源等关键性问题，因此具有独特优势。
技术实现要素：
本发明提供一种真菌Penicillium citrinum HL-5126分离自红树尖瓣海莲，红树尖瓣海莲是第一发明人于2012年采自中国海南东寨港红树林自然保护区(Natural Product Research，2016，30(7)，821-825)。
本发明提供一类由上述红树尖瓣海莲内生真菌Penicillium citrinum HL-5126产生的次级代谢产物或其药学上可接受的盐，其特征在于所述次级代谢产物具有如下结构：
本发明提供一种同时制备化合物1-7或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)先在菌种培养基中对真菌Penicillium citrinum HL-5126进行菌种培养；
(2)再在发酵培养基中对步骤(1)中的真菌Penicillium citrinum HL-5126进行发酵培养；
(3)将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3～5次，合并萃取液后减压浓缩得到发酵液浸膏；
(4)步骤(3)得到的发酵液浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0至0:100梯度洗脱，将其按照极性大小分成5个组分Fr.1～Fr.5；将Fr.3组分以石油醚-乙酸乙酯10∶2为洗脱剂经正相硅胶柱层析后，再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为CHCl3∶MeOH＝1∶1，最后经高效液相色谱HPLC制备，所用色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为MeOH∶H2O＝85∶15，最终得到化合物1-7。
其中所述洗脱剂或流动相的比例均为体积比；所述菌种培养基中含有葡萄糖0.1％–5.0％、酵母膏0.01％–2％、蛋白胨0.01％–2％、琼脂0.1％–3.0％、粗海盐0.05％–5％、适量的水，培养温度为20–25℃，培养时间为5-10天；所述发酵培养基中含有葡萄糖0.1％–5.0％、酵母膏0.01％–2％、蛋白胨0.01％–2％、粗海盐0.05％–5％，培养温度为20–25℃，培养时间为25–30天；上述百分比均为重量百分比。
本发明提供化合物1的晶体结构，其特征在于其X-射线单晶衍射数据为： 斜方晶系，空间群P212121，晶胞参数为α＝90°,β＝90°,γ＝90°，Z＝4,Dx＝1.318mg/mm3,F(000)＝640,μ(Cu Kα)＝0.848mm-1,2681个可观测点[I>2σ(I)]，可观测点精修最终偏离因子R＝0.083，wR＝0.0707，Flack常数为0.0(3)。
本发明提供化合物1晶体的制备方法，其特征在于将化合物1溶于极性溶剂中，自然结晶得到，所述极性溶剂为甲醇、乙醇或乙酸乙酯。
本发明提供一种抗菌剂，其特征在于包含化合物1-7、其晶体或其药学上可接受的盐作为活性成分。
本发明提供的上述抗菌剂，还可以包括其他抗菌药物；也可以包括药学上可接受的载体。
本发明提供化合物1-7、其晶体或其药学上可接受的盐在制备抗菌药物方面的用途。所述抗菌药物用于抑制表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌或弧菌。
本发明所述晶体结构以双子超衍射仪(Xcalibur,Atlas,Gemini ultra diffractometer)采用Cu Kα射线在120.01(10)K下扫描收集衍射数据。
本发明中术语“药学上可接受的盐”是指非毒性的无机或有机酸和/或碱的加成盐，可参见“Salt selection for basic drugs”,Int.J.Pharm.(1986),33,201–217。
附图说明
说明书附图1为化合物1的XRD图。
具体实施方式
为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。
实施例1
(1)红树尖瓣海莲内生真菌Penicillium citrinum HL-5126的菌种培养
菌种培养所用的培养基含有葡萄糖5.0％(重量百分比，下同)、酵母膏2％、蛋白胨2％、琼脂3％、粗海盐5.0％，其余为水；使用时制成试管斜面，真菌菌株在25℃下培养5天。
(2)红树尖瓣海莲内生真菌Penicillium citrinum HL-5126的发酵
发酵培养所用的培养基含有葡萄糖5.0％(重量百分比，下同)、酵母膏2％、蛋白胨2％、氯化钠5％，其余为水；真菌菌株于25℃培养30天。
(3)化合物1-7的提取分离
取20L步骤(2)得到的发酵液过滤，除去菌体，将滤液浓缩后，用等体积的乙酸乙酯萃取3次；萃取液浓缩后经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0至0∶100梯度洗脱，将其按照极性大小分成5个组分Fr.1～Fr.5；将Fr.3组分以石油醚-乙酸乙酯10∶2为洗脱剂经正相硅胶柱层析后，再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为CHCl3∶MeOH＝1∶1，最后经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为MeOH∶H2O＝85∶15，最终得到化合物1(5.0mg)、化合物2(5.0mg)、化合物3(6.2mg)、化合物4(6.0mg)、化合物5(8.0mg)、化合物6(10.0mg)、化合物7(7.0mg)。
经结构确证，化合物1-3为新化合物，化合物4-7表征数据与已知报道的数据一致，在本发明中不在赘述。
化合物1-3的NMR数据(400MHz 1H NMR，100MHz 13C NMR)
化合物1：无色晶体，[α]24D＝–29.0(c＝0.25,MeOH).mp 118.8–120.4℃；λmax(logε)220(3.02),246(2.50),312(1.62)nm；CD(c 2×10-4mol/L,MeOH)λmax(Δε),259(-23.0),280(-2.5),330(-13.6)；IR(KBr)νmax 3518,1712,1602,1272,1250,1230,1112,1082,1064,798cm–1；HRESIMS m/z 281.1384[M+H]+(calcd for C15H21O5,281.1383).
化合物2：无色晶体，[α]24D＝–24.6(c＝0.25,MeOH).mp 136.9–137.6℃.λmax(logε)220(3.02),246(2.50),312(1.62)nm；CD(0.52Mm,MeOH)λmax(Δε)239(+2.00),257(-8.60),290(-1.52),329(-3.10)；IR(KBr)νmax 3518,1712,1602,1272,1250,1230,1112,1082,1064,798cm–1；HRESIMS m/z 579.2200[2M+Na]+(calcd for C30H36O10Na,579.2200).
化合物3：无色晶体，[α]24D＝–12.0(c＝0.25,MeOH).λmax(logε)220(3.02),246(2.50),312(1.62)nm；CD(0.52Mm,MeOH)λmax(Δε)240(+9.60),260(-2.65),328(-0.16)；IR(KBr)νmax 3518,1712,1602,1272,1250,1230,1112,1082,1064,798cm–1；HRESIMS m/z 273.0733[M+Na]+(calcd for C30H36O10Na,273.0740).
实施例2
将实施例1中菌种培养基中成分调整为葡萄糖0.1％、酵母膏0.01％、蛋白胨0.01％、琼脂0.1％、粗海盐0.05％、适量的水，培养温度为20℃，培养时间为10天；所述发酵培养基中成分调整为含有葡萄糖0.1％、酵母膏0.01％、蛋白胨 0.01％、粗海盐0.05％，培养温度为25℃，培养时间为25天；上述百分比均为重量百分比。仍能以类似的收率得到化合物1-7。
实施例3
取2.0mg化合物1溶于2mL甲醇中，静止自然结晶，4天后得到无色晶体，其晶体结构以双子超衍射仪(Xcalibur,Atlas,Gemini ultra diffractometer)采用Cu Kα射线在120.01(10)K下扫描收集衍射数据。
化合物1晶体：斜方晶系，空间群P212121，晶胞参数为α＝90°,β＝90°,γ＝90°，Z＝4,Dx＝1.318mg/mm3,F(000)＝640,μ(Cu Kα)＝0.848mm-1,2681个可观测点[I>2σ(I)]，可观测点精修最终偏离因子R＝0.083，wR＝0.0707，Flack常数为0.0(3)。
此外，将化合物1溶于乙醇或乙酸乙酯中，静止3-7天均能得到上述晶体。
实施例4本发明的化合物的抗菌活性的测定
本发明的化合物按照文献方法(Pierce C.G.；Uppuluri P.；Teistan A.R.；Wormley Jr.F.L.；Mowat E.；Ramage G.；Lopez-ribot J.L.Nat.Protoc.2008，3，1494-1500)，测试对4株革兰氏阳性菌：蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、弧菌(V.alginolyticus)的抗菌活性。如表1所示。
表1本发明的化合物对细菌的抑制活性