专利名称：中国地生兰花原生细胞胚消化酶干预培养法的制作方法
技术领域：
本发明是一种中国地生兰花原生细胞胚消化酶干预培养法。
背景技术：
中国地生兰花种子极细，细如尘埃，种子内仅有一个发育不完全的胚， 没有胚芽和胚乳，不具备种子的基本结构，没有供其萌发的营养物质，还不能称其为种子， 只能称其为原生细胞胚，加之有一层翅羽状种皮，种皮不易吸收水分，如莲瓣兰种子泡在水中三年以上也不能吸收到水分和外部提供的营养物质，在自然界中必须靠某种真菌菌丝穿透其种皮为其提供营养才能诱发根状茎龙根，不同的兰花所需的真菌各不相同，人们至今未能分离到能作用于中国兰花的真菌，各科研机构经过多年研究，仅仅分离到可供腐生兰天麻萌发的小菇真菌，和供其生长所需的密环菌。所以，人工繁殖天麻得以成功，其他兰花还不能自然繁殖。用常规方法播种不能萌发，故需要人工突破种皮后再由培养基来供给养份才能使原生细胞胚萌发，突破种皮现有技术是用氢氧化钠溶液或酸溶液来浸泡腐蚀种皮，破皮后氢氧化钠溶液或酸溶液同时也腐蚀了细胞胚，使其失活，难以控制得恰到好处， 成功率极低，在加上中国地生兰花不能诱导产生原球茎，而是在未知真菌作用下偶然产生根状茎龙根，龙根在底下潜伏生长多年后形成龙根蛋或龙根球后，才分化出兰花实生苗，人工诱导根状茎龙根目前是个技术难题，此技术以前一直以日本、台湾领先，经数十年研究， 国内外有个别成功启动的报道但很难实现重复成功启动，再加上启动根状茎龙根成功率极低，一直以来未能达到批量生产目的，洋兰(如大花蕙兰和蝴蝶兰)不产生根状茎，直接由茎尖组织或种子产生原球茎，即可分化出从生芽，培养比较简单所以日本、台湾早已实现产业化生产，出口至世界各地赚取了大量外汇，而幽香高洁、号称“王者之香”的中国地生兰花至今不能产业化生产，因此在物以稀为贵的原因下，前几年有人将国兰炒到了几十万、甚至几百万一苗的天价，损害兰花爱好者的利益。本发明旨在突破国兰产业化的技术瓶颈，并取得了成功。发明内容本发明的目的是提出一种中国地生兰花原生细胞胚消化酶干预培养法，该方法能够有效破解中国地生兰花果实中细胞胚的种皮，同时又不损伤细胞胚本身，使细胞胚能吸收到周围营养和水分，细胞能分化发育成种苗，并且有高的细胞胚启动率，以此解决现有技术的难题。本发明提出的这种中国地生兰花原生细胞胚消化酶干预培养法，其特征在于它有如下步骤(1)蜗牛酶消化酶的提取从田间收集活的大蜗牛，饥饿两天后用水冲洗干净，轻轻敲碎，并小心剥去外壳，顺消化道剪开体壁，剥离出消化道，从嗉囊和胃里抽取棕色消化液，用离心机以离心分层后，留上清液，弃掉沉淀物，用无菌滤膜注射器过滤纯净上清液待用；(2)细胞胚预处理选用尚未开裂的兰花果实，表面用75%的酒精灭菌后，用10% 次氯酸钠浸泡5 10分钟，用无菌水冲洗3次完成表面消毒后，在无菌操作台上切开果子， 将其中的原生细胞胚粉粒倒入置于100毫升消化酶溶液中25°C度浸泡30-50分钟，用滴管吸取少量含有细胞胚粉粒的液体在相差显微镜下观察，在显微镜下观察到翅羽状种皮开始降解时，立即停止浸泡并用无菌水冲洗至少3次，用滤纸过滤原生细胞胚粉粒；
(3)稀释将过滤出的细胞胚粉粒放入启动有丝分离液体营养液中稀释；(4)接种将第C3)步含有细胞胚粉粒的液体培养液接种于试管中的基础固体营
养基上；(5)暗培养接种好的试管在25°C恒温状态下在旋转床上震荡暗培养，直到可观察到细胞胚粉粒开始膨大，细胞胚有丝分离开始；(6)光照培养此时转为在1300LX光强下每天照射12h光照培养，恒温25°C条件下静置培养，直到可观察到白色细胞团膨大至l_3mm，颜色转绿，在下部长出白色生长点 1-6个，逐渐向下钻入固体营养基，此时已完成了试管内兰花根状茎(又名“龙根”)启动过程；(7)分化将根状茎转接于分化固体营养基中生长点朝下插入营养基，25°C光强 2000LX条件下，培养60d左右生长点开始不断向下生长至2-3cm，根状茎开始转向折头向上生长，直至钻出固体营养基表面，这时生长点分化为芽点并长出子叶；(8)生根将根状茎转接于壮苗生根固体营养基上，芽点朝上根状茎朝下，25°C光强2500LX条件下培养60d，根状茎与子叶交界处长出肉质气生兰根，子叶中心长出完整兰花苗；(9)炼苗移栽将兰花苗连龙根一起从试管中移出，洗净根部附着的营养基，用 1/1000浓度的多菌灵消毒后，晾干至气生根发白时，移栽至经高温消毒的腐质基质中。第(1)步的消化酶上清液，现取现用，间隔不超过一天，以保持其活性。第⑵步有消化酶溶液配比组成是蜗牛消化酶上清液30ml，山梨醇0. lg, pH值调至5. 8，无菌水稀释至100ml。第(3)步的启动有丝分离液体培养基配方是N6+蔗糖20g+6BA2. Omg+NAAO. 2mg+ 香蕉提取液IOOml+活性碳2g。第⑷步的基础固体营养基配方是1/4MS+马铃薯泥50g+活性碳3g+强度为1300 的琼脂粉3. 2g。第(7)步的分化固体营养基配方是1/4MS+6BA0. 5mg+NAA0. 5mg+马铃薯泥IOOg+ 活性碳3g+强度为1300的琼脂粉3. 7g。第(8)步的壮苗生根固体营养基配方1/2MS+6BA0. 2mg+IBA2. 5mg+马铃薯泥 IOOg+香蕉泥IOOg+活性碳3g+强度为1300的琼脂粉3. 7g。第(5)步暗培养的时间为70-90天，一般以80天为宜。第(6)步的培养天数为40-60天，以50天为宜。本发明采用大蜗牛的消化酶，作用于地生兰花原生细胞胚翅羽状种皮，在不使用腐蚀性液体的条件下通过酶的作用降解了兰花种皮，同时对中国地生兰花原生细胞胚几乎没有损伤，极大提高了培养的成功率，甚至可实现有菌自然播种。发明人用此方法，实现了所有兰科植物的原生细胞胚启动根状茎的无菌培养，甚至连豆瓣系兰花这样的被日本台湾科学家称为“单向基因，不太可能组培”的植物原生细胞胚启动根状茎的无菌培养成功率达到100%，其中莲瓣兰，豆瓣兰，兜兰，春兰，寒兰，绿兰，秋枝，墨兰，剑叶兰等品系中，共实验 91个品种，所有受试品种达到惊人的100%培养成功，为此打开了号称“王者之香”的中国地生兰花的大批量人工培养的技术瓶颈，解决了这个世界性难题。应用该方法，我们在多年的培养过程中，培养出了莲瓣兰、豆瓣兰、兜兰、春剑、春
5兰、寒兰、绿兰、秋枝、墨兰、剑叶兰等品系。所有受试兰花品系中共实验91个品种全部启动了根状茎龙根的生成，细胞胚启动率可达75%以上，全部分化出了完整的植株，平均每个兰花果荪可培养出3000-5000苗兰花成苗，增加根状茎龙根分化转接次数可实现无限量中国地生兰花种苗周年生产。中国兰花是世界濒危野生珍稀植物，其花香高雅、尊贵，国兰精油是唯一无法人工合成的香料，价格是黄金的数十倍。更由于国兰花种苗难育，传统方式仅靠分株繁殖，数量十分稀缺，使得兰花精油的价格逐年快速攀升。本发明从根本上解决了中国兰花人工育苗的世界性难题，谁优先知晓、掌握本发明谁就拥有巨大商机，形成垄断，形成巨大产业。因此，本发明可能涉及国家重大经济利益。
图1是莲瓣兰细胞胚经消化酶处理后培养180天，启动形成根状茎向下生长实况图。图2莲瓣兰根状茎转瓶后180天形成龙根蛋实况图。图3是莲瓣兰龙根在分化培养基中培养120天后分化出完整小苗实况图。图4是出瓶移栽60天成活的莲瓣兰实况图。
具体实施方式
下面是实施本发明的具体实例1、蜗牛酶消化酶的提取(1)从田间收集足够多的活大蜗牛；(2)活蜗牛饥饿两天后；(3)用水冲洗干净，轻轻敲碎，并小心剥去外壳；(4)顺消化道剪开体壁，剥离出消化道，从嗉囊和胃里抽取棕色消化液。每只大蜗牛平均可得到IML的消化液；(5)用离心机10000转/分，离心10分钟，留上清液，弃掉沉淀物；(6)用无菌滤膜漏斗过滤，收集的滤液呈棕褐色，只能现提取现用，否则会很快失去活性。2、预处理选用尚未开裂的兰花果实，表面用75%的酒精灭菌后，用10%次氯酸钠浸泡5 10分钟，取出再用无菌水冲洗3次完成表面消毒后，在无菌操作台上切开果子，将其中的原生细胞胚粉粒倒入置于100毫升消化酶(配方见附配-1)溶液中25度浸泡30-50分钟，用滴管吸取少量含有细胞胚粉粒的液体在相差显微镜下观察，发现翅羽状种皮开始降解时， 立即停止处理，用无菌水冲洗至少3次，用滤纸过滤原生细胞胚粉粒，准备接种，整个操作过程必须严格在无菌环境中进行。3、稀释将过滤出的细胞胚粉粒放入启动有丝分离液体配养基(配方见附配- 中稀释到 50粒/ml浓度。4、接种将上述含有细胞胚粉粒的液体培养液按aiil/瓶的接种量接种于基础固体营养基上(配方见附配_3)，5、暗培养接种好的试管在25°C恒温状态下在旋转床上震荡暗培养80d，可观察到细胞胚粉粒开始膨大，色白，细胞胚有丝分离开始。6、光照培养此时转为在1300LX光强下每天照射1 光照培养，恒温25°C条件下静置培养 50d，可观察到0. Imm以下的白色细胞团继续膨大至l_3mm，颜色转绿，在下部长出白色生长点1-6个，逐渐向下钻入固体营养基，此时已完成了试管内国兰根状茎(又名“龙根”)启动过程，7、分化在超净工作台上将根状茎转接于分化固体营养基(配方见附配-4)中生长点朝下插入营养基，25°C光强2000LX条件下，培养60d左右生长点开始不断向下生长至2-3cm时， 出现有趣的现象，根状茎开始转向折头向上生长，直至钻出固体营养基表面，这时生长点分化为芽点并长出子叶。8、生根在超净工作台上将根状茎转接于壮苗生根固体营养基(配方见附配巧)上，芽点朝上根状茎朝下，25°C光强2500LX条件下培养60d根状茎与子叶交界处长出肉质气生兰根，子叶中心长出完整兰花苗。9、炼苗移栽将兰花苗连龙根一起从试管中移出，洗净根部附着的营养基，用1/1000浓度的多菌灵消毒后，晾干至气生根发白时，移栽至经高温消毒的腐质基质中。附配-1 消化酶液配方蜗牛消化酶上清液30ml，山梨醇0. lg, pH值调至5. 8，无菌水稀释至IOOml备用。附配-2 启动有丝分离液体配养基配方N6+ 蔗糖 20g+6BA2. Omg+NAAO. 2mg+ 香蕉提取液 IOOml+ 活性碳 2g 的附配-3 基础固体营养基配方1/4MS+马铃薯泥50g+活性碳3g+强度为1300的琼脂粉3. 2g附配-4 分化固体营养基1/4MS+6BA0. 5mg+NAA0. 5mg+马铃薯泥IOOg+活性碳3g+强度为1300的琼脂粉 3. 7g附配-5 壮苗生根固体营养基1/2MS+6BA0. 2mg+IBA2. 5mg+马铃薯泥 IOOg+香蕉泥 IOOg+活性碳 3g+强度为 1300 的琼脂粉3. 7g。利用本例的方法培养出来的莲瓣兰、豆瓣兰、兜兰、春剑、春兰、寒兰、绿兰、秋枝、 墨兰、剑叶兰、兰花细胞胚的具体启动率如下表。
权利要求
1.一种中国地生兰花原生细胞胚消化酶干预培养法，其特征在于它有如下步骤(1)蜗牛酶消化酶的提取从田间收集活的大蜗牛，饥饿两天用水冲洗干净，敲碎，小心剥去外壳，顺消化道剪开体壁，剥离出消化道，从嗉囊和胃里抽取棕色消化液，用离心机离心分层，留上清液，弃掉沉淀物，过滤纯净上清液待用；(2)细胞胚预处理选用未开裂的兰花果实，表面用75%的酒精灭菌，用10%次氯酸钠浸泡5 10分钟，取出用无菌水冲洗3次完成表面消毒，切开果子，将其中的原生细胞胚粉粒倒入消化酶溶液中25°C度浸泡30-50分钟，翅羽状种皮开始降解时，停止浸泡，用无菌水冲洗至少3次，用滤纸过滤原生细胞胚粉粒；(3)稀释将过滤出的细胞胚粉粒放入启动有丝分离液体培养基中稀释；(4)接种将第C3)步含有细胞胚粉粒的液体培养液接种于试管中的基础固体营养基上(5)暗培养接种好的试管在25°C恒温状态下，在旋转床上震荡暗培养，直至可观察到细胞胚粉粒开始膨大，细胞胚有丝分离开始；(6)光照培养接上步，此时转为在1300LX光强下，每天照射12h光照培养，恒温25°C 条件下静置培养，直到试管内兰花根状茎(龙根)启动；(7)分化将根状茎转接于分化固体营养基中，生长点朝下插入营养基，25°C光强 2000LX条件下，培养60d左右生长点开始不断向下生长至2-3cm，根状茎开始转向折头向上生长，直至钻出固体营养基表面，这时生长点分化为芽点并长出子叶；(8)生根将根状茎转接于壮苗生根固体营养基上，芽点朝上根状茎朝下，25°C光强 2500LX条件下培养60d，根状茎与子叶交界处长出肉质气生兰根，子叶中心长出完整兰花苗；(9)炼苗移栽将兰花苗连龙根一起从试管中移出，洗净根部附着的营养基，用1/1000 浓度的多菌灵消毒后，晾干至气生根发白时，移栽至经高温消毒的腐质基质中。
2.根据权利要求1所述中国地生兰花原生细胞胚消化酶干预培养法，其特征在于第(1)步的消化酶上清液，现取现用，间隔不超过一天，以保持其活性。
3.根据权利要求1所述中国地生兰花原生细胞胚消化酶干预培养法，其特征在于第(2)步的消化酶溶液配方是蜗牛消化酶上清液30ml，山梨醇0.lg, pH值调至5. 8，无菌水稀释至100ml。
4.根据权利要求1所述中国地生兰花原生细胞胚消化酶干预培养法，其特征在于第(3)步的启动有丝分离液体培养基配方是N6+蔗糖20g+6BA2.Omg+NAAO. 2mg+香蕉提取液 IOOml+活性碳2g。
5.根据权利要求1所述中国地生兰花原生细胞胚消化酶干预培养法，其特征在于第(4)步的基础固体营养基配方是1/4MS+马铃薯泥50g+活性碳3g+强度为1300的琼脂粉 3. 2go
6.根据权利要求1所述中国地生兰花原生细胞胚消化酶干预培养法，其特征在于第(7)步的分化固体营养基配方是1/4MS+6BA0.5mg+NAA0. 5mg+马铃薯泥IOOg+活性碳3g+ 强度为1300的琼脂粉3. 7g。
7.根据权利要求1所述中国地生兰花原生细胞胚消化酶干预培养法，其特征在于第(8)步的壮苗生根固体营养基配方1/2MS+6BA0.2mg+IBA2. 5mg+马铃薯泥IOOg+香蕉泥IOOg+活性碳3g+强度为1300的琼脂粉3. 7g。
8.根据权利要求1所述中国地生兰花原生细胞胚消化酶干预培养法，其特征在于第(5)步暗培养的时间为70-90天，一般以80天为宜。
9.根据权利要求1所述中国地生兰花原生细胞胚消化酶干预培养法，其特征在于第(6)步的培养天数为40-60天，以50天为宜。
全文摘要
本发明涉及中国地生兰花原生细胞胚消化酶干预培养法，步骤是将饥饿两天活蜗牛敲碎，剥离出消化道，从嗉囊和胃里抽取消化液并作净化处理得上清液，配备成消化酶溶液；选用兰花果实作消毒处理，取出种子粉粒，将其中的原生细胞胚粉粒倒入消化酶溶液浸泡到翅羽状种皮开始降解时过滤原生细胞胚粉粒；将过滤出的细胞胚粉粒放入启动有丝分离液体培养基中，稀释并接种于试管中的基础固体营养基上；试管25℃恒温在旋转床上震荡暗培养，让细胞胚分离；在1300LX光强下每天照射12h，恒温25℃条件下静置培养，直到下部长出生长点；分化生根；炼苗移栽得种苗。本发明首开利用动物消化酶降解兰花原生细胞胚种皮先河，成功培育出了90余种珍稀国兰品种，细胞胚启动成功率达到75％，受试品种全部启动，解决了濒危珍贵物种人工育种的世界难题。
文档编号A01H4/00GK102334450SQ20111026118
公开日2012年2月1日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年8月30日
发明者张笑逸 申请人:张笑逸