专利名称：以badh作为标记基因的植物转基因选择系统及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及以BADH作为标记基因的植物转基因选择系统及其应用。
背景技术：
运用基因工程技术实现植物性状的遗传改良已经成为培育植物新品种的一种新趋势。在植物转基因过程中，有效的选择系统的采用是植物转基因成功与否的一个关键环节。目前最常用的选择系统为除草剂选择系统和抗生素选择系统，尽管这两种选择系统已经成功地用于多种植物的遗传转化，但这两种选择系统的采用却是引发公众对转基因生物安全性关注的一个重要原因。一方面，人们担心转基因植物中的抗生素抗性基因会转移到环境微生物中，结果会导致抗性病原体的增加；另一方面，抗除草剂基因可能会传给野生杂草，从而使杂草获得除草剂抗性。虽然这些担心还没有科学依据，但公众对选择标记基因的潜在危害的担心会严重影响植物基因工程的发展，所以，建立安全有效的植物遗传转化的选择系统，培育无抗性标记基因的转基因植物在基因工程育种上有着重要意义。当前，解决转基因植物中抗性标记基因安全性问题有两种途径(1)转化时仍使用抗性标记基因，转基因植物再生成功后，在释放大田前将抗性标记基因剔除；( 发展安全性标记基因用于植物遗传转化(赵艳，王慧中，于彦春等.转基因植物中标记基因的安全性新策略[J].遗传，2003,25(1) :119-122)。由于前一种途径操作复杂，不利于转基因植物的快速商品化应用，因此目前在植物转基因操作上多倾向于采用安全性标记基因的遗传转化法。甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因是甜菜碱代谢途径中的关键酶，该酶能把对植物有毒的甜菜碱醛(又名甲酰甲基三甲基氯化胺，英文名Betaine aldehyde chloride ；分子式C5H12C1N0)转化为有利的甜菜碱，是国际上公认的安全性基因，并可兼作标记基因使用。许多转基因成果表明外源BADH基因的导入可提高植物合成甜菜碱的能力，并增强植物的抗旱性、耐盐性等(Sakamoto A, Murata N. The role of glycine betaine in protection of plants from stress clues from transgenic plants[J]. Plant Cell and Evironment,2002,25 :163-171 ；付光明，苏乔，吴畏等.转BADH基因玉米的获得及其耐盐性[J].辽宁师范大学学气，2006，四(3) :344-347)。目前，以甜菜碱醛脱氢酶基因兼作标记 SHEliini ^ (H Daniell, B Muthukumar, S B Lee. Marker free transgenic plants engineeringthe chloroplast genome without the use of antibiotic selection[J]. Current Genetics, 2001, 39 (2) :109-116)、二色胡枝子(杨晓红· BADH 基因、反义 4CL 基因对二色胡枝子的遗传转化研究[D].北京林业大学博士学位论文，2009)上取得了成功。尽管这种遗传转化技术已经被证实是可行的，但是该种转化方法是以甜菜碱醛提供选择压， 而甜菜碱醛则是一种价格极其昂贵的选择剂，国际市场价高达1000美元/克左右，国内价格也达2500 3000元/克，造成该种遗传转化成本极高，进而限制了这种遗传转化方法的广泛使用。因此，探索以甜菜碱醛脱氢酶基因兼作标记基因的低成本遗传转化方法，对促进这种安全性遗传转化方法的广泛使用和转基因成果的快速商品化应用具有重要意义。
发明内容
NaCl是种对植物组织、细胞发育产生毒害的化合物，其产生的Na+在细胞中大量积累会破坏细胞内离子平衡并抑制细胞内生理生化代谢过程，使植物光合作用能力下降， 最终因碳饥饿而死亡。植物在含有一定浓度的NaCl培养基上则不能进行正常的组织分化， NaCl浓度高时，植物会死亡。但NaCl价格低廉，每500克才6 8元人民币，在市场上很容易买到。在以BADH基因兼作选择标记基因时，由NaCl提供选择压，以这种成本低廉的化合物作为选择剂，对拟转化的植物外植体，先将其置于含有不同浓度的NaCl培养基上，观察 NaCl对植物组织分化的影响程度，找到正好能抑制植物组织进行分化的NaCl浓度，以此浓度作为植物遗传转化过程中NaCl选择剂浓度。由于转入BADH基因的植物组织或细胞具有提高耐盐性的特点，因此，在含有一定浓度的NaCl培养基上，转BADH基因的细胞或组织能够正常分化生长，非转化细胞或组织不能分化，从而可获得具有NaCl抗性的抗性芽，这些抗性芽可作为转入外源基因的植株初始材料。以后，使这些抗性芽进一步在含有一定浓度的NaCl培养基上生长发育，并对其进行分子检测，就能够获得以BADH基因兼做标记基因的转基因植株。为了解决目前在采用BADH作为外源基因的标记基因、以甜菜碱醛提供选择压时， 所造成的遗传转化成本极高的问题，本发明提供了一种以BADH作为标记基因时的植物转基因选择系统并同时提供了这种植物转基因选择系统的应用。以BADH作为标记基因的植物转基因选择系统，包含外源基因和选择剂，其中，所述外源基因中含有作为选择标记基因的BADH，所述选择剂为NaCl。上述技术方案所述的植物转基因选择系统，其中，所述植物为二色胡枝子或烟草。上述技术方案中所述的以BADH作为标记基因的植物转基因选择系统在植物转基因工程中的应用，包括通过转基因方法将以BADH作为选择标记基因的外源基因导入植物中，其中，还包括下述步骤(1)、在转基因前的植物的组织或细胞培养基中加入不同浓度的NaCl，确定正好能抑制植物组织或细胞进行分化的NaCl浓度；O)、将获得的可能转化了外源基因的具有NaCl抗性的组织或细胞放置在步骤 (1)所确定的NaCl浓度的培养基上进行培养，能够生长发育的即为转入了 BADH作为选择标记基因的外源基因的材料。上述技术方案中所述的应用，其中，以BADH作为标记基因的植物转基因选择系统在二色胡枝子或烟草转基因工程中的应用。上述技术方案中所述的应用，包括通过转基因方法将以BADH为标记基因的外源基因转入二色胡枝子中的步骤，其中，还包括下述步骤(1)、在转基因前二色胡枝子子叶节不定芽分化的培养基中加入不同浓度的NaCl， 确定正好能抑制二色胡枝子子叶节不定芽分化的NaCl浓度；O)、将上述转入了外源基因的二色胡枝子子叶节置于含有步骤(1)中确定的 NaCl浓度的相同培养基中进行选择；(3)、在转基因前二色胡枝子不定芽增殖和生根的培养基中加入不同浓度的NaCl， 确定正好能抑制二色胡枝子不定芽增殖和生根的NaCl浓度；
(4)、将步骤O)中获得的耐盐抗性芽在步骤(3)所确定的NaCl浓度的培养基中进行选择性增殖和生根，以加强选择效果。上述技术方案中所述的应用，包括通过转基因方法将以BADH为标记基因的外源基因转入烟草叶片中的步骤，其中，还包括下述步骤(1)、在转基因前烟草叶片不定芽分化的培养基中加入不同浓度的NaCl，确定正好能抑制烟草叶片不定芽分化的NaCl浓度；(2)、将转入了外源基因的烟草叶片置于含有步骤⑴中确定的NaCl浓度的相同培养基中进行选择；(3)、在转基因前烟草茎段增殖和组培苗生根的培养基中加入不同浓度的NaCl，确定正好能抑制烟草茎段增殖和组培苗生根的NaCl浓度；(4)、将步骤O)中获得的烟草耐盐抗性芽在步骤(3)所确定的NaCl浓度的培养基中进行选择性茎段增殖和组培苗生根，以加强选择效果。上述技术方案中任一技术方案所述的应用，其中，在经过含NaCl培养基进行选择之后还包括经分子检测进行确定的步骤；所述分子检测优选为PCR检测或Southern检测。本发明具有以下有益效果1、由于本发明采用NaCl作为选择剂，与现在常用的甜菜碱醛相比，大大降低了在转基因试验中的成本投入；2、当采用NaCl作为选择剂，以BADH基因为标记基因进行外源基因遗传转化时，可以使甜菜碱醛脱氢酶基因在转基因工程中大规模使用，解决了目前采用除草剂选择系统和抗生素选择系统所造成的转基因生物安全性问题，为建立安全有效的植物遗传转化的选择系统提供了低成本的可能性；3、以NaCl作为选择剂，以BADH基因兼作标记基因对植物进行遗传转化，所得转基因植物容易很快通过国家转基因安全评价，进行商业生产。
1、图1为转基因前二色胡枝子子叶节在不含NaCl的培养基上；2、图2为转基因前二色胡枝子子叶节在含0. 8g/L NaCl的培养基上；3、图3为转基因前二色胡枝子在不含NaCl的培养基上的茎段增殖；4、图4为转基因前二色胡枝子在含0. 8g/L NaCl的培养基上的增殖表现；5、图5为转基因前二色胡枝子在不含NaCl的培养基上生根；6、图6为转基因前二色胡枝子在含0. 5g/L NaCl的培养基上的生根表现；7、图7为在NaCl选择剂上转基因二色胡枝子子叶节抗性芽；8、图8为二色胡枝子转化植株PCR检测结果；9、图9为二色胡枝子转化植株Southern检测结果；10、图10为转基因前烟草叶片在不含NaCl的培养基上分化；11、图11为转基因前烟草叶片在含2g/L的NaCl的培养基上分化情况；12、图12为转基因前烟草茎段在不含NaCl的培养基中增殖与生根；13、图13为转基因前烟草茎段在含2g/L的NaCl的培养基上表现情况；14、图14为在NaCl选择剂上的转基因烟草抗性芽；
15、图15为烟草转化植株PCR检测结果；16、图16为烟草转化植株Southern检测结果；17、图17为转入基因之后的二色胡枝子在含1. Og/L NaCl的培养基上的增殖表现；18、图18为转入基因之后的二色胡枝子在含1. Og/L NaCl的培养基上的生根表现；19、图19为转入基因之后的烟草在含3g/L的NaCl的培养基上表现。
具体实施例方式为使本发明的技术方案便于理解，以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。以下实施例中植物转基因部分、外源基因的遗传转化部分的试验操作按照本领域技术人员公知的操作方法进行操作，也可以按照引证文件中所述的方法进行操作。实施例1:以BADH基因兼做标记基因，以NaCl作为选择剂对二色胡枝子进行遗传转化过程一、确定抑制二色胡枝子子叶节不定芽分化的NaCl浓度根据二色胡枝子遗传转化过程采用的外植体为子叶节，子叶节在MS+6-BA 0. aiig/L+3%蔗糖+6g/L琼脂的培养基上不定芽分化效果最好，以此培养基为基础，配置含有不同浓度NaCl的培养基，如 MS+6-BA0. ang/L+3% 蔗糖+6g/L 琼脂+NaCl 0. 4g/L、MS+6_BA 0. ang/L+3% 蔗糖+6g/L 琼脂 +NaClO. 6g/L、MS+6-BA 0. 2mg/L+3%蔗糖+6g/L 琼脂+NaCl 0. 8g/L、MS+6_BA 0. 2mg/L+3% 蔗糖+6g/L琼脂+NaCl 1. Og/L等系列培养基，观察子叶节在这些培养基上的不定芽分化情况，由于二色胡枝子子叶节在MS+6-BA 0. ang/L+3%蔗糖+6g/L琼脂+NaCl 0. 8g/L培养基上不能分化出不定芽，因此，认为培养基中添加0. 8g -L-1NaCl就能抑制不定芽分化，该浓度就是以NaCl作为选择剂对二色胡枝子进行遗传转化时的选择压。在子叶节不定芽分化效果最好的MS+6-BA 0. ang/L+3%蔗糖+6g/L琼脂的培养基上加入0. Sg · I^1NaCl,得到选择培养基，将以BADH为标记基因的外源基因转化后的二色胡枝子子叶节放置在选择培养基中进行筛选；图1为转基因前二色胡枝子子叶节在不含NaCl的培养基上表现，图2为转基因前二色胡枝子子叶节在含0. 8g/L NaCl的培养基上表现，图7为在NaCl选择剂上转基因二色胡枝子子叶节抗性芽。二、了解NaCl浓度对二色胡枝子不定芽增殖和生根的影响二色胡枝子不定芽增殖适宜的培养基为MS+6-BA 1. 0mg/L+NAA 0. lmg/L，生根培养基为MS+IBA 0. 4mg/ L+NAA0. 2mg/L0在这些培养基基础上添加不同浓度的NaCl，观察不定芽增殖或生根情况， 发现不定芽在含有0. Sg · L-1NaCl的培养基上不能增殖，在含有0. 5g · L^NaCl的培养基上不能生根，因此，确定培养基中添加0. Sg · L-1NaCl作为遗传转化获得的抗性芽增值过程中的选择压，培养基中添加0. 5g · L-1NaCl作为二色胡枝子抗性芽生根培养过程中的选择压， 图3为转化前二色胡枝子在不含NaCl的培养基上的茎段增殖，图5为转化前二色胡枝子在不含NaCl的培养基上生根，图4为转化前二色胡枝子在含0. 8g/L NaCl的培养基上的增殖表现，图6为转化前二色胡枝子在含0. 5g/L NaCl的培养基上的生根表现，图8为二色胡枝子转基因植株PCR检测结果，图9为二色胡枝子转基因植株Southern检测结果，其中在图 8和图9中ck+为阳性对照(即含有外源基因的质粒DNA)，ck-为阴性对照(即非转基因株)，B2 B3 B4 B5代表基因转入后出现4个能在NaCl选择剂上生长的株系，经过PCR检测，有条带的B3、B5株系才是转基因植株。图17为转入基因之后的二色胡枝子在含l.Og/ L NaCl的培养基上的茎段增值表现；图18为转入基因之后的二色胡枝子在含1. Og/L NaCl 的培养基上生根。实施例2 以BADH基因兼做标记基因，以NaCl作为选择剂对烟草进行遗传转化一、了解NaCl浓度对烟草叶片不定芽分化能力的影响烟草叶片分化的适宜培养基为1/2MS+6-BA 2. Omg/L+NAA 0. lmg/L+3%蔗糖+6g/L琼脂。在此培养基的基础上，分别添加0,0. 4,0. 8,1. 2,1. 6,2. 0,3. Og/L的NaCl，观察烟草叶片在各种培养基上的生长表现， 确定在培养基中添加2g/L NaCl就能够抑制烟草叶片分化不定芽；在烟草叶片分化的适宜培养基1/2MS+6-BA 2. Omg/L+NAA 0. lmg/L+3%蔗糖+6g/ L琼脂上加入2g · I^1NaCl,得到选择培养基，将以BADH为标记基因的外源基因转化后的烟草叶片放置在选择培养基中进行筛选；图10为转基因前烟草叶片在不含NaCl的培养基上分化，图11为转基因前烟草叶片在含2g/L的NaCl的培养基上分化情况，图14为在NaCl选择剂上的转基因烟草叶片抗性芽；二、了解NaCl浓度对烟草茎段增殖能力、组培苗生根能力的影响烟草茎段增殖的适宜培养基为1/2MS+6-BA 1. Omg/L+NAA 0. lmg/L+3%蔗糖+6g/L琼脂；生根适宜培养基为 1/2MS+IAA0. 5mg/L+3%蔗糖+6g/L 琼脂。分别配制添加有 0. 4,0. 8,1. 2,1. 6,2. 0,3. Og/ L的NaCl的茎段增殖、生根培养基，确定在培养基中添加2g/L的NaCl就能够抑制烟草茎段进一步分化增殖和组培苗生根。因此，以培养基中添加2g/L的NaCl作为烟草叶片遗传转化中的选择压和抗性芽增殖生根过程中的选择压，图12为转基因前烟草茎段在不含NaCl 的培养基中增殖与生根，图13为转基因前烟草茎段在含ang/L的NaCl的培养基上表现情况，图15为烟草转化植株PCR检测结果，图16为烟草转化植株Southern检测结果，在图15 和图16中ck+为阳性对照，ck-为阴性对照(即非转基因株)，Y2 Υ3Υ4 Υ6 Υ8代表基因转入后出现5个能在NaCl选择剂上生长的株系编号，经过PCR检测，有条带的Υ4、Υ6株系才是转基因植株。图19为基因转入之后的烟草植株在含3g/L的NaCl培养基上的表现。以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
权利要求
1.以BADH作为标记基因的植物转基因选择系统，包含外源基因和选择剂，其特征在于所述外源基因中含有作为选择标记基因的BADH，所述选择剂为NaCl。
2.根据权利要求1所述的植物转基因选择系统，其特征在于所述植物为二色胡枝子或烟草。
3.权利要求1所述的以BADH作为标记基因的植物转基因选择系统在植物转基因工程中的应用，包括通过转基因方法将包含BADH作为选择标记基因的外源基因导入植物中，其特征在于还包括下述步骤(1)、在转基因前的植物的组织或细胞培养基中加入不同浓度的NaCl，确定正好能抑制植物组织或细胞进行分化的NaCl浓度；O)、将获得的可能转化了外源基因的具有NaCl抗性的组织或细胞放置在步骤(1)所确定的NaCl浓度的培养基上进行培养，能够生长发育的即为转入了 BADH作为选择标记基因的外源基因的材料。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于以BADH作为标记基因的植物转基因选择系统在二色胡枝子或烟草转基因工程中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，包括通过转基因方法将包含BADH作为标记基因的外源基因转入二色胡枝子中的步骤，其特征在于还包括下述步骤(1)、在转基因前二色胡枝子子叶节不定芽分化的培养基中加入不同浓度的NaCl，确定正好能抑制二色胡枝子子叶节不定芽分化的NaCl浓度；O)、将上述转入了外源基因的二色胡枝子子叶节置于含有步骤(1)中确定的NaCl浓度的相同培养基中进行选择；(3)、在转基因前二色胡枝子不定芽增殖和生根的培养基中加入不同浓度的NaCl，确定正好能抑制二色胡枝子不定芽增殖和生根的NaCl浓度；G)、将步骤O)中获得的耐盐抗性芽在步骤(3)所确定的NaCl浓度的培养基中进行选择性增殖和生根，以加强选择效果。
6.根据权利要求4所述的应用，包括通过转基因方法将包含BADH作为标记基因的外源基因转入烟草叶片中的步骤，其特征在于，还包括下述步骤(1)、在转基因前烟草叶片不定芽分化的培养基中加入不同浓度的NaCl，确定正好能抑制烟草叶片不定芽分化的NaCl浓度；O)、将转入了外源基因的烟草叶片置于含有步骤(1)中确定的NaCl浓度的相同培养基中进行选择；(3)、在转基因前烟草茎段增殖和组培苗生根的培养基中加入不同浓度的NaCl，确定正好能抑制烟草茎段增殖和组培苗生根的NaCl浓度；G)、将步骤O)中获得的烟草耐盐抗性芽在步骤(3)所确定的NaCl浓度的培养基中进行选择性茎段增殖和组培苗生根，以加强选择效果。
7.根据权利要求3 6中任一权利要求所述的应用，其特征在于在经过含NaCl培养基进行选择之后还包括经分子检测进行确定的步骤。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述分子检测为PCR检测或Southern检测。
全文摘要
本发明以BADH作为标记基因的植物转基因选择系统及其应用，属于基因工程技术领域。该系统以BADH作为外源基因的标记基因，以NaCl作为选择剂；其应用包括下述步骤(1)确定正好能抑制植物组织分化的NaCl浓度；(2)将含有BADH基因的外源基因转化入植物细胞或组织中；(3)将转化了BADH标记基因的转基因组织或细胞放置在步骤(1)所确定的NaCl浓度的培养基上进行培养，能够生长发育的即为可能转化了BADH标记基因的转基因组织或细胞，经分子检测进行确定。本发明具有大大降低了在转基因试验中的成本投入；解决了转基因生物安全性问题，为建立安全有效的植物遗传转化的选择系统提供了低成本选择的优点。
文档编号A01H5/00GK102304506SQ201110260718
公开日2012年1月4日 申请日期2011年9月6日 优先权日2011年9月6日
发明者冷平生, 刘雯, 杨晓红, 解小娟, 陈晓阳 申请人:北京农学院