一种用于抗体药物偶联物的毒素及其制备方法与流程

本发明涉及药物化学领域，特别涉及一种用于抗体药物偶联物的毒素及其制备方法
背景技术：
：抗体药物偶联物(antibodydrugconjugate，简称adc)是一类新型的抗肿瘤药物，其原理是将细胞毒素连接在抗体上，通过抗体对癌细胞表面特定抗原的识别，经过内吞作用进入癌细胞，从而将细胞毒素运输到靶点，达到靶向性治疗恶性肿瘤的目的。adc与传统的小分子抗肿瘤药物相比，因能借助抗体的靶向识别性与毒素的高活性，故更具备特异性和有效性。adc包括三个不同的组成部分，即抗体、连接子和细胞毒素。抗体实现靶向性，连接子保证在adc在血液转运过程中的稳定性，而到达作用靶点后，毒素发挥对癌细胞的杀伤作用。根据作用机制的不同，适用于adc的毒素分为微管类抑制剂(microtubuleinhibitors)，dna损伤剂(dnadamagingagents)，rna聚合酶抑制剂(rnapolymeraseinhibitors)等。目前，市场上销售和临床试验中的adc所采用的毒素主要为微管类抑制剂，主要包括基于海兔毒素(dolastatin-based)设计的化合物，比如mmae、mmaf和mmad，以及基于美登素(maytansine-based)设计的化合物，比如dm1和dm4。其中美登素系列化合物由于原料昂贵且化学不稳定，适用范围又不如海兔毒素系列。海兔毒素系列化合物的主要问题是合成步骤长，分析和质量控制困难，从而造成化学合成工艺难以稳定，进而阻碍了商业化生产。那么，如何找到一种新型的，既可以在细胞作用机制、以及活性上与海兔毒素系列相近，合成又较为适合工业化生产的毒素，则成为adc研究领域的一个课题。技术实现要素：针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种作用机制和活性与现有毒素相当，但合成操作更简单，更适应大规模工业生产的毒素，以及其相应的合成路线。duostatin5是一种基于海兔毒素而设计的细胞毒素，它能满足在adc中作为有效细胞毒素的需要，但合成步骤较少，容易操作，质量控制难度较小，化学合成工艺较为稳定，适合进一步工业化生产。因此，本发明的一个目的是提供一种用于抗体药物偶联物的毒素。本发明的另一目的是提供一种制备上述毒素的方法。实现本发明目的的技术方案如下：一方面，本发明提供一种用于抗体药物偶联物的毒素，该毒素为式(i)所示的化合物、对映异构体、外消旋体或其药学上可接受的盐：另一方面，本发明提供一种制备上述毒素的方法。该方法合成步骤较少，容易操作，质量控制难度较小，化学合成工艺较为稳定，适合进一步工业化生产。为了达到这个目的，我们设计了以下技术方案：具体地，上述毒素的制备方法包括以下步骤：1)将化合物1或其盐与化合物2溶解于溶剂中，在试剂a的作用下经缩合反应得到化合物3；2)将化合物3从步骤1)得到的反应液中分离；3)将步骤2)得到的化合物3溶解于溶剂中，在试剂b的作用下脱掉氨基保护基m，得到化合物4；4)将化合物4从步骤3)得到的反应液中分离；5)步骤4)得到的化合物4与化合物dmt在试剂c的作用下经缩合反应得到化合物5；6)将化合物5从步骤5)得到的反应液中分离；7)将步骤6)得到的化合物5溶解于溶剂中，在试剂d的作用下，脱去氨基保护基l，得到式(i)的化合物；8)将式(i)的化合物从步骤7)得到的反应液中分离；其中化合物中的m和l为氨基保护基，且m与l不同。优选地，在步骤1)中，所述溶剂选自二氯甲烷、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、四氢呋喃、1,4-二氧六环和2-甲基四氢呋喃中的一种或多种；更优选地，所述溶剂选自二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺中的一种或多种。优选地，在步骤1)中，所述试剂a选自dcc、edc、dic、hatu、hbtu、hbpipu、hbpyu、hspyu、hctu、hotu、hott、hstu、hdma、tatu、tbtu、tctu、tcfh、tdbtu、totu、tott、tptu、tffh、btffh、tntu、tstu、comu、t3p、bop、pybop、pybrop、pyclop、brop、pyaop、pyciu、cdi、tpsi、tstu、depbt、dmtmm、eedq、cip、cib、dmc、hobt和edci中的一种或多种；更优选地，所述试剂a选自edci、edc、dic、hoat和hobt中的一种或多种；进一步优选地，所述试剂a为edci、edc或dic与hoat或hobt的混合物；最优选地，所述试剂a为edci和hobt的混合物；优选地，在步骤1)中，所述试剂a作为最后一个组分加入到反应液中。优选地，在步骤1)中，反应温度为-20℃-100℃，优选为15℃-30℃。优选地，在步骤1)中，所述氨基保护基m选自cbz、boc、troc、tr，优选为boc。优选地，在步骤1)中，所述氨基保护基l选自fmoc、sem，优选为fmoc。优选地，在步骤2)中，所述分离包括将所述反应液用水或饱和食盐水洗涤，并蒸去溶剂，重结晶得到化合物3。优选地，在步骤3)中，所述溶剂选自n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氯甲烷和乙腈中的一种或多种；更优选地，所述溶剂为乙腈或二氯甲烷。优选地，在步骤3)中，所述试剂b选自但不限于氯化氢-1,4-二氧六环溶液，氯化氢-乙醇溶液，氯化氢-甲醇溶液，氯化氢-乙醚溶液，三氟乙酸，乙酸，甲酸和二氯甲烷，更优选为氯化氢-1,4-二氧六环溶液或二氯甲烷。优选地，在步骤3)中，反应温度为0℃-100℃，优选为15℃-30℃。优选地，在步骤4)中，通过蒸干溶剂的方法得到化合物4。优选地，在步骤5)中，所述溶剂为1,4-二氧六环、n,n-二甲基甲酰胺、乙腈、二氯甲烷、氯仿或1,2-二氯乙烷，更优选地为二氯甲烷。优选地，在步骤5)中，所述试剂c选自dcc、edc、dic、hatu、hbtu、hbpipu、hbpyu、hspyu、hctu、hotu、hott、hstu、hdma、tatu、tbtu、tctu、tcfh、tdbtu、totu、tott、tptu、tffh、btffh、tntu、tstu、comu、t3p、bop、pybop、pybrop、pyclop、brop、pyaop、pyciu、cdi、tpsi、tstu、depbt、dmtmm、eedq、cip、cib、dmc、hoat、hobt、hbot、dipea和edci中的一种或多种；更优选地，所述试剂c选自edc、dic、hoat、hobt、hbot、dipea和edci中的一种或多种；最优选地，所述试剂c为dipea与hbot和edci的混合物；优选地，在步骤5)中，反应温度为-20℃-100℃，优选为15℃-30℃。优选地，在步骤6)中，所述反应液用水或饱和食盐水洗涤，并蒸去溶剂，得到化合物5。优选地，在步骤7)中，所述溶剂为1,4-二氧六环，n,n-二甲基甲酰胺，乙腈，二氯甲烷，氯仿或1,2-二氯乙烷，更优选地为二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺。优选地，在步骤7)中，所述试剂d选自但不限于dbu、哌啶、乙二胺、二异丙胺、吗啉、n-甲基哌嗪、吡咯烷、二乙基胺和二甲基胺中的一种或多种；更优选地，所述试剂d选自哌啶、二乙基胺、二甲基胺和二异丙胺中的一种或多种，最优选为二乙基胺或二甲基胺。优选地，在步骤8)中，所述分离包括所述反应液在减压下除去溶剂，重结晶，以得到式(i)的化合物。如本文所用，常用的缩写及其定义如表1所示：表1缩写定义缩写定义aq.水溶液tlc薄层层析boc或boc叔丁基氧羰基μl微升troc三氯乙基氧羰基ms质谱tr三苯甲基pab对氨基苄基fmoc9-芴甲基氧羰基lc/ms液质联用sem2-三甲基硅基乙氧甲基氧羰基eq当量hplc高效液相℃摄氏度ml毫升h小时g克如本文所用，常用的有机物缩写的定义及其相应的cas号如表2所示：表2本发明提供的用于抗体药物偶联物的毒素的活性与海兔毒素系列的化合物的活性相当，并且，本毒素在分子结构上，用于接链接子的功能基团为苯胺上的氨基，反应活性较mmae系列的单甲基n端要好，此外，本发明提供的所述毒素的合成方法适于合成步骤较少，容易操作，质量控制难度较小，化学合成工艺较为稳定，更适合进一步工业化生产。附图说明图1：化合物v的核磁图谱；图2：化合物3的核磁图谱；图3：化合物5的核磁图谱；图4：式(i)化合物的核磁图谱；图5：式(i)的化合物、mmae和mmaf对四种癌细胞系的ec50。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步非限制性的详细说明。需要指出的是，下述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。实施例1：式(i)化合物(m＝boc，l＝fmoc)的制备本实施例的反应路线如下：1.1化合物2的制备将化合物ii(1.3kg，3.55mol)溶于二氯甲烷(3l)，原料不能完全溶解，降温至0℃，加入et3n(718g，7.10mol)原料全部溶解，滴加mscl(447g，3.90mol)，保持温度在5℃以下，反应2h，点板检测反应完全，反应液用水，食盐水洗涤后干燥，过滤，浓缩，得化合物iii1.6kg(收率101％)。将化合物iii(1.6kg，3.6mol)，溶于dmf(12l)，加入nan3(1.2kg,18mol)加热至65℃，反应3h，点板检测原料大部分反应掉，且有副产物产生，终止反应，将反应液加入到冰水中，用乙酸乙酯萃取，有机相用食盐水洗涤，干燥，过滤，浓缩的粗品，过柱纯化(pe:ea＝10:1)，得到化合物iv400g(收率28％)。将化合物iv(400g,1.02mol)溶于1l1,4-二氧六环中降温至0℃，加入3lhcl-1,4-二氧六环，室温反应过夜，lcms检测反应完全，将反应液加到5l甲基叔丁基醚中，产品析出，过滤，将滤饼干燥，得化合物v204g(收率75.8％)。所得化合物v的核磁图谱示于图1。将化合物v(204g,772mmol)溶于水(2l)，降温至0℃，加入na2co3调节ph到中性，加入acoh调节ph＝3-4，加入fmoc-cl(200g,772mmol)的thf(1l)溶液，反应室温过夜，lcms显示反应完全，加入na2co3调节ph＝8-9，乙酸乙酯(ea)萃取，有机相合并后用水洗涤。有机相干燥过滤浓缩得粗品，过柱纯化(二氯甲烷:meoh＝150:1)，得化合物2180g(收率56％)。1.2化合物3的制备将化合物1(48g,167.04mmol)，合成方法参考tetrahedronp913-1924.1993)，化合物2(76g，167.04mmol)溶于1.5l的二氯甲烷中，冰浴降温至0℃，加入edci(96g,501.13mmol),hobt(22.57g,167.04mmol)，在n2保护下室温反应过夜，反应液用水洗涤一次，柠檬酸洗涤两次，na2co3水溶液洗涤两次，食盐水洗涤，有机相干燥过滤浓缩得粗品110g,粗品用2l的乙酸乙酯溶解，过滤掉不溶物，加入8l正己烷，将混合溶剂加热至澄清，静置降温结晶，过滤得滤饼(即化合物3)80g(收率85％)。所得的化合物3的核磁图谱示于图2。1.3化合物4的制备将化合物3(80g,117.3mmol)溶于400ml二氯甲烷中，降温至0℃，加入hcl-1,4-二氧六环150ml，室温反应4h，lcms检测原料反应完全，浓缩，溶剂拉干得产品(化合物4)70g。所得的产品直接用于下一步反应。1.4化合物5的制备将化合物4(135g,219.01mmol)，dmt(132.7g,284.71mmol)，合成方法参考chemicalandpharmaceuticalbulletin,1995,v43,p1706-1718)溶于1.5l的二氯甲烷中，降温至0℃，n2保护。加入dipea(85g，657.03mmol),edci(84g，438.02mmol)、hbot(59.2g，438.02mmol)，0℃下搅拌30分钟，升温至25℃反应过夜。lcms检测原料反应完全。溶剂旋干。将粗品溶于柠檬酸水溶液中(4l)。水相用mtbe(2l*3)萃取。点板至产品点上方杂质点消失。调节水相ph＝8-9，乙酸乙酯萃取。有机相干燥过滤浓缩得产品210g,hplc检测纯度94％。重结晶得到产品(化合物5)175g(收率99％)。所得的化合物5的核磁图谱示于图3。1.5式(i)化合物的制备将化合物5(180g,181.04mmol)溶于1l的二氯甲烷，dmf(300ml)中，降温至0℃，加入二乙基胺(300ml)，25℃下反应12-15小时，lcms检测反应完全。溶剂拉干，粗品用500ml的二氯甲烷溶解，滴加到正己烷:二氯甲烷＝16l:400ml中，重结晶并烘干得125g产品(即式(i)化合物)(收率98％)。所得的式(i)化合物的核磁图谱示于图4。实施例2：具有不同靶点表达量的癌细胞系ags、nci-h460、mda-mb-231和pc-3(购自美国atcc公司)铺在96孔板里。将式(i)化合物、mmae和mmaf(购自美国mce公司)分别连续稀释并加入到细胞中处理3天。处理结束时，细胞增长量由promega的celltitreglo测定ec50。图5显示了式(i)的化合物、mmae和mmaf对ags、mci-h460、mda-mb-231和pc-3四种癌细胞系抑制达到50％时所需要的浓度，即ec50。可以看到式(i)的化合物与mmae基本相当，对mda-mb-231细胞系的ec50略优；与mmaf相比，式(i)的化合物则更优胜。实施例3：化合物3的制备将化合物1(50g,174.21mmol)，合成方法参考tetrahedronp913-1924.1993)，化合物2(80g，174.0mmol)溶于1.5l的二氯甲烷中，冰浴降温至0℃，加入hatu(76g,200mmol)在n2保护下室温反应过夜，反应液用水洗涤一次，柠檬酸洗涤两次，na2co3水溶液洗涤两次，食盐水洗涤，有机相干燥过滤浓缩得粗品90g,粗品用柱层析得到产品(即化合物3)50g(收率60％)。实施例4：式(i)化合物的制备将化合物5(18g,18.1mmol)溶于1l的二氯甲烷，dmf(30ml)中，降温至0℃，加入二甲基胺(30ml)，25℃下反应15-25小时，lcms检测反应完全。溶剂拉干，柱层析纯化得到10g(产率70％)产品(即式(i)化合物)。当前第1页12