一种微囊包被抗奶牛乳房炎主要致病菌卵黄抗体IgY的制备方法和应用与流程

技术领域

本发明涉及兽用生物制品制备技术领域，具体涉及一种微囊包被抗奶牛乳房炎主要致病菌卵黄抗体IgY的制备方法和应用。

背景技术：

奶牛乳房炎是由物理、化学或微生物等因素刺激奶牛乳腺所引发的一种炎症反应，其中多种病原微生物的感染是引起奶牛乳房炎的主要病因。目前，奶牛乳房炎主要应用抗菌素、中药、疫苗进行防治，但在用药方式和治疗方法上存在以下主要弊端：（1）抗生素是奶牛乳房炎首选治疗药物，但存在单一药物抗菌谱不够广、耐药性、药物残留蓄积、肠道菌群失调的问题。（2）中药治疗的时效性差，效果不理想，而且奶中残留的中药影响牛奶风味，多作为奶牛乳房炎的辅助治疗手段。（3）疫苗防治最常见的问题是细菌抗原的变异，使得免疫系统在产生新的抗体时总是落后于细菌，所以很难对临床上发病群体和混合感染的奶牛乳房炎起到良好的防治效果。因此，急需开发新型生物制剂从其它角度去解决该问题，用于预防和降低奶牛乳房炎发病率、控制病原菌在牛群中流行、提高牛奶的产量和质量，为生产优质“无抗奶”创造条件。

特异性卵黄抗体IgY 是一种良好的免疫球蛋白资源，无污染，无残留，具有高度的稳定性，对热、酸、碱具有较强的耐受性，可以针对不同抗原制备特异性抗体，专一性抑制杀灭病原体，近年来受到了国内外学者的高度关注。卵黄抗体IgY 的应用与其生物学特性密切相关，国内在兽医临床上的应用较多，主要用于多种禽类疫病的防治，而且，特异性卵黄抗体IgY 目前还被应用到一些疑似病、新病的防治研究中。研究表明，口服特异性卵黄抗体IgY 可成功用于防治动物和人类因细菌、病毒感染引起的消化道疾病，如幽门螺杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、轮状病毒等引起的胃肠道感染，其效果呈剂量依赖性。口服特异性卵黄抗体IgY 在远离肠道部位的乳腺亦能够有效抑制细菌的生长，国外Coleman(1996)用抗无乳链球菌和抗金黄色葡萄球菌的IgY 抗体给泌乳期奶牛服用，结果牛奶的SCC 值很快降低，乳房炎病情得到控制。然而，特异性卵黄抗体IgY 在极强胃酸环境中易被降解而失活，制约其在口服制剂中的实际应用，加之，反刍动物消化道结构功能较为复杂，内部微生态环境中的微生物、酶的种类和功能更加多样，使得常规的口服制剂若不经过制剂过程处理，卵黄抗体IgY 易在胃内降解，从而减弱其生物学活性甚至完全消失。

生物微囊（Microcapsule，MC）技术是实现蛋白质药物口服给药最有希望的解决途径之一，在动物科学、畜牧生产领域已有广泛的应用，多数作为饲料添加剂、药品的制剂。微囊化技术是利用天然或合成的高分子材料（统称为囊材）作为囊膜壁壳(Membrane wall)，通过生物材料相互作用，将固态或液态药剂（统称为囊芯物）包裹，形成药库型微型胶囊，简称微囊。其外型一般呈球形，直径一般在1-1.5 mm，膜为一层或多层，微囊中的芯材料可以是多个颗粒。微囊制剂可隔离物料间的相互作用，保护敏感性物料，增加产品的稳定性，保护微囊内生物分子被酶解、酸碱降解。同时，微囊膜具有选择通透特性，可控制有效成分的释放速度，延长与胃肠道的接触时间，从而达到缓慢释放的目的。理论分析及实践表明，微囊这种多单元剂型具有长效、高效、靶向和低副作用等特点及优良的控制性能，在药物控制释放等领域具有广泛的应用前景。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明根据兽药类非抗生素生物制剂的发展方向，利用产蛋鸡受到外来抗原（奶牛乳房炎4种主要致病菌）的刺激会产业免疫应答，并生成相应抗体且抗体主要累计于卵黄这一特点，以产蛋鸡为生物转换器，大量、连续的生产抗奶牛乳房炎主要致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白IgY（Dominate pathogens of bovine mastitis, 抗DP-BM-IgY），可为生产无公害、无污染的生物制品和药物提供源头材料。同时，针对抗DP-BM-IgY 在口服给药途径所面临的消化道酶屏障及酸屏障，以抗DP-BM-IgY 为药物模型，利用微囊化技术包被抗DP-BM-IgY，制成免疫球蛋白载药微囊对其进行适当保护，以确保抗DP-BM-IgY 在胃酸环境中抵抗胃酸的破坏以及胃蛋白酶的降解作用。同时，保证DP-BM-IgY 在胃中不释放，而在小肠中快速、持续的释放出完整的抗DP-BM-IgY，从而稳定发挥其生物学功效，提高药物生物利用度。

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，针对奶牛乳房炎防治的3大主要问题，提供一种方便、高效、无毒副作用的非抗生素生物制剂，用于防治链球菌、葡萄球菌、G^-杆菌引起的奶牛乳房炎，即一种微囊包被抗奶牛乳房炎耐药致病菌卵黄抗体IgY的制备方法和应用。具体为：

（1）提供可用于免疫健康产蛋鸡的主要致病菌菌体蛋白抗原物质及其制备方法；

（2）提供一种分离提纯含有高效价抗奶牛乳房炎主要致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白IgY（抗DP-BM-IgY）的方法；

（3）提供一种可供口服应用的、包被有抗DP-BM-IgY的微囊制剂及其制备方法；

（4）提供抗DP-BM-IgY微囊制剂在防治奶牛临床型乳房炎和隐性乳房炎方面的用途。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种微囊包被抗奶牛乳房炎耐药致病菌卵黄抗体IgY的制备方法，包括以下步骤：

1）奶牛乳房炎4种主要致病菌单菌浓缩蛋白抗原及复合抗原的制备：

a）主要致病菌扩大培养：选取带有特定抗原的致病性牛源无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌，致病菌的培养是以血琼脂斜面培养基进行传代、培养，镜检无杂菌，得到纯种；分别将4种主要致病菌接种于内含5%-10%犊牛血清的LB肉汤培养基中进行扩大培养，离心收集细菌细胞；

b）单菌浓缩蛋白抗原的制备：将菌沉淀按照每1克湿菌+3 mL pH 7.0 的PBS缓冲液的比例，漂洗2-3 次，按每1克湿菌+5 mL细胞裂解液的比例，混悬细菌细胞，20-37 ℃温育10-20 min，细菌细胞破碎后的匀浆液采用超声破碎，超声时间 5s，间歇时间 10 s，超声 20 min，超声功率400 W，10000 rpm冷冻离心10 min，弃去细菌碎片沉淀，上清即为含有目的蛋白的粗提物；取上清，18000 rpm离心30 min，弃上清，沉淀用0.5 %的十二烷基肌氨酸钠悬浮，4℃作用1 h，18000 rpm离心30 min；弃上清，沉淀用双蒸水混悬，用改良Bradford法测定目的菌体蛋白浓度，将其浓度调节到1.0 mg/mL，分装后-20 ℃保存，备用；

c）菌体蛋白抗原复合物的制备：将相同蛋白浓度的4种单一抗原进行等浓度组合即得复合菌体蛋白抗原；

2）多价菌体蛋白抗原免疫物的制备及动物免疫方案：

将制备的复合菌体蛋白抗原加入等量弗氏佐剂混合，其中初次免疫选用弗氏完全佐剂FCA，加强免疫均选用弗氏不完全佐剂FIA，采用快速乳化法，冰浴条件下，利用超声波粉碎仪反复乳化3-4 次，每次乳化10-15s，置4 ℃冰箱，间隔1 min，直至完全乳化抗原和佐剂混合物；免疫健康产蛋母鸡，收集免疫鸡产下的蛋，备用；

3）抗奶牛乳房炎主要致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白IgY，即抗DP-BM-IgY的分离与纯化：

将步骤2）中收集的高免鸡蛋用碘酒和酒精棉球进行消毒处理，分离蛋黄和蛋清，去除干净蛋黄表面的白蛋白，刺破蛋黄膜，收集无膜卵黄液并计量体积；取卵黄液 + 去离子水以体积比1：（6-10） 的比例混合，每个鸡蛋的卵黄液平均计为15 mL，pH 值调至5.0-6.0，-20 ℃过夜，4 ℃解冻，将析出的上清液及卵黄沉淀于4 ℃条件下离心，离心转速为8000-10000 rpm，时间为10 min，弃去脂肪沉淀，收集上清液，根据上清液的体积加入质量体积比4 % 的PEG-6000，轻轻搅拌使其完全溶解，4 ℃静置2-3 h，混合液在4 ℃条件下离心，离心转速为8000-10000 rpm，时间为10 min，以进一步去除卵黄中的磷脂，收集上清液，根据上清液的体积加入质量体积比12 % 的PEG-6000，轻轻搅拌使其完全溶解，4 ℃静置1-2 h，以沉淀其中的蛋白抗体；0℃、10000 rpm 的条件下离心15-20 min，使最终获得的卵黄源抗DP-BM-IgY抗体转移入沉淀中，弃上清液，用少量0.1M PBS溶液溶解沉淀，用改良Bradford法测定其中抗DP-BM-IgY卵黄抗体的蛋白浓度，并将其浓度调节到0.5 g/mL，转移至小管，0℃保存，备用；

4）微囊包被配方的制备：

A）配制2.0 % 的海藻酸钠水溶液：称取2.0 g 海藻酸钠溶于100 mL 去离子水中，用磁力搅拌器搅拌至溶解，待用；

B）配制2.0 %的CaCl₂溶液，即成囊溶液一：称取2.0 g氯化钙溶于100 mL去离子水中，用磁力搅拌器搅拌至溶解，待用；

C）配制2.0 % 的壳聚糖溶液，即成囊溶液二：称取2.0 g壳聚糖，加10% 醋酸搅拌溶解，加去离子水稀释至100 mL，pH 为3.0-4.5，待用；

D）乳化剂：内含体积比为0.1%-0.4%的司班-80的植物油20 mL，植物油选用大豆色拉油；

E）配制1.0 %的CaCl₂溶液，为洗涤用溶液：称取10 g 氯化钙溶于1000 mL 去离子水中，用磁力搅拌器搅拌至溶解，待用；

5）包被抗DP-BM-IgY的微囊制剂的制备：

将步骤 3）制备获得的抗DP-BM-IgY卵黄抗体液缓慢加入到步骤 4）步骤A）的海藻酸钠水溶液中，其中，抗DP-BM-IgY卵黄抗体与海藻酸钠的质量比为1：（2-1），即投药量为20-40 mg/mL；加入0.5 %的乳化剂大豆色拉油，在37 ℃、400 rpm磁力搅拌的作用下，均质乳化15 -20 min，形成均匀浑浊乳状液；

6）采用挤压法进行成囊反应：

将步骤 5）制成的抗DP-BM-IgY卵黄抗体液与海藻酸钠水溶液的均质乳化液，通过注射器挤压滴入到步骤4）步骤B）2.0 %的CaCl₂溶液中进行包被，包被搅拌速率为100-150 rpm，4号针头距液面8-10 cm，滴加速度30 滴/min；反应完成后，静置固化30 min；去除上清液，将微球用步骤4）步骤E）1.0 %的CaCl₂溶液洗涤；再与步骤4）步骤C）2.0 % 的壳聚糖溶液反应，充分混合，进一步固化30 min；将微球用去离子水清洗过滤，自然干燥或冷冻干燥，制得平均粒径为1-1.5 mm的、包被有抗DP-BM-IgY的卵黄抗体微囊产品。

本发明的第二个目的是提供了上述一种微囊包被抗奶牛乳房炎主要致病菌卵黄抗体IgY的制备方法所获得的抗DP-BM-IgY的卵黄抗体微囊产品，所述抗DP-BM-IgY的卵黄抗体微囊产品为肠溶微囊制剂，给药途径为口服。

本发明的第三个目的是提供了上述抗DP-BM-IgY的卵黄抗体微囊制剂在制备用于预防和治疗奶牛临床型乳房炎和隐性乳房炎的药物中的应用。

进一步的，上述的应用，所述微囊制剂主要用于防治由链球菌、葡萄球菌及G^—杆菌（包括对抗生素和杀菌剂呈现耐药性的耐药菌）引起的奶牛乳房炎。

本发明的技术重点在于：

1、本发明提供一种制备奶牛乳房炎4种主要致病菌的单菌浓缩蛋白抗原，并将其制成多价菌体蛋白抗原物质的方法。在本部分发明中，首先根据我国奶牛乳房炎流行病学研究资料，筛选在泌乳奶牛中占优势的主要致病菌，优选出的用于制备多价菌体蛋白抗原的主要致病菌为：无乳链球菌（S.agalactiae，CVCC55901，牛源）、停乳链球菌（S.dysgalactiae，CVCC55935 牛源）、金黄色葡萄球菌（S.aurrus，CVCC 8029 牛源）及大肠杆菌（E.coli，O157:K88，CVCC1489 牛源），购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）。主要致病菌的体外扩大培养可在适宜的营养肉汤培养物中进行，优选的是加有5-10 %犊牛血清的营养肉汤。采用细菌裂解液结合超声细胞破碎方法，分别制备单一抗原，单一抗原进行等浓度组合即得所需的复合抗原。

2、本发明提供一种优选的动物免疫方案，将制备的复合菌体蛋白抗原加入一定量的佐剂，优选的方案是将制备的10 mL 复合菌体蛋白抗原与等量的弗氏完全佐剂混合，充分乳化，用于初次免疫健康产蛋母鸡。在加强免疫（二免、三免）时使用等量弗氏不完全佐剂混合，免疫效果更好。

3、本发明提供一种从高免鸡蛋的卵黄中高效纯化抗DP-BM-IgY的方法，具体地，采用水稀释法－冷冻法－聚乙二醇沉淀法分离提纯抗DP-BM-IgY，首先将卵黄用6-10倍体积磷酸缓冲液稀释，调整pH 值至5.0-6.0，经冷冻、解冻、离心去除脂肪沉淀，收集的上清液经4 %、12 %的PEG-6000进一步去除卵黄磷脂及蛋白沉淀后，冷冻离心获得特异性抗DP-BM-IgY。本发明提供的纯化方案技术方案简便实用，脱脂、沉淀蛋白效果好，纯化后的免疫球蛋白活性高，纯度可达90 %以上。

4、本发明提供一种包被有抗DP-BM-IgY的、不受胃酸和胃蛋白酶破坏的微囊制剂的制备方法，该口服制剂易于泌乳乳牛的服用，可在小肠中快速、持续的释放出完整的抗DP-BM-IgY，药物的生物利用度较高，可明显提高抗DP-BM-IgY的防治效果。

本发明的机理与作用（即有益效果）为：

选用牛源无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，制备主要致病菌复合菌体蛋白抗原，加弗氏佐剂制备抗原复合物免疫高产蛋鸡，以蛋鸡为生物转换器，收取鸡蛋并从中获取卵黄源抗DP-BM-IgY抗体。取海藻酸钠（NaAlG）水溶液与卵黄源抗DP-BM-IgY抗体液进行均质乳化，采用挤压法，将乳化好的溶液滴入CaCl₂、壳聚糖组成的成囊溶液中进行包被及固化。将获得微囊包被的卵黄源抗DP-BM-IgY抗体，经去离子水洗净、晾干。包被后的成品保护了抗DP-BM-IgY卵黄抗体的有效活性，在模拟人工胃液中2 h 内未完全溶解，可抵抗胃酸、胃蛋白酶及胃内微生物的降解，而在模拟人工肠液中10 min后便可释放，保证抗DP-BM-IgY卵黄抗体在小肠中快速、持续的释放，具有较好的肠溶性。本发明利用微囊技术，选用壳聚糖和海藻酸钠为包被材料，包被材料均为天然多糖，资源丰富，价格便宜，口服应用无任何毒副作用，柔韧性好，外观呈半透明球形，粒径分布在900-1200 μm，该方法可操作性强，彰显技术进步。

附图说明

图 1为提取的抗DP-BM-IgY卵黄抗体纯度检测结果。

图 2为抗DP-BM-IgY微囊制备产品。

图 3为抗DP-BM-IgY微囊在模拟胃液及人工肠液中的释放曲线图。

其中，如图所示：抗DP-BM-IgY微囊在模拟胃液中的前1 h内，释放量很少，在模拟胃液的第1-2 h区间，释放率有所增加达8.81%。结果证明，以壳聚糖-海藻酸钠作为包被材料制得的抗DP-BM-IgY微囊对胃蛋白酶有较好的抵抗力，可有效抵御pH 2.0的胃酸作用而不至于崩解。而抗DP-BM-IgY微囊在pH 7.4 的模拟肠液中，浸泡10min 后即可快速释放，在第1 h期间释放率达到最高，随后，释放量缓慢下降，逐渐趋于平稳，为缓慢释放，在模拟肠液中4 h，可基本释放完全。表明抗DP-BM-IgY微囊对胰蛋白酶十分敏感，具有肠溶性。

具体实施方式

实施例1：

主要致病菌菌体蛋白抗原复合物的制备：

（1）选取具有特定抗原的致病性无乳链球菌（S.agalactiae，CVCC55901，牛源）、停乳链球菌（S.dysgalactiae，CVCC55935 牛源）、金黄色葡萄球菌（S.aurrus，CVCC 8029 牛源）及大肠杆菌（E.coli，O157:K88，CVCC1489 牛源）。主要致病菌的培养优选为均以血琼脂斜面培养基进行传代，37 ℃培养24 h，染色镜检无杂菌，得到纯种。分别将4种主要致病菌接种于肉汤培养基（内含5-10 %犊牛血清）中进行扩大培养，置37 ℃恒温振荡培养箱中(150-200 r/min)，培养24 h，离心收集细菌细胞。

（2）单菌浓缩蛋白抗原的制备：将菌沉淀按照每克湿菌 + 3 mL pH 7.0 的PBS缓冲液的比例，漂洗2-3 次。按每克湿菌 + 5 mL细胞裂解液的比例，混悬细菌细胞，20-37 ℃温育10-20 min，同时轻轻摇动。细菌细胞破碎后的匀浆液用超声波粉碎仪超声破碎（超声时间 5s，间歇时间 10 s，超声 20 min，功率 400 W），10000 rpm冷冻离心10 min，弃去细菌碎片沉淀，上清即为含有目的蛋白的粗提物。取上清，18300 rpm离心30 min。弃上清，沉淀用0.5 %十二烷基肌氨酸钠悬浮，4 ℃作用1 h，18300 rpm离心30 min。弃上清，沉淀用双蒸水混悬，用改良Bradford法测定目的菌体蛋白浓度，将其浓度调节到1 mg/mL，分装后－20 ℃保存，备用。

（3）菌体蛋白抗原复合物的制备：将相同蛋白浓度的4种单一抗原进行等浓度组合即得复合菌体蛋白抗原。

实施例2：

多价菌体蛋白抗原免疫物的制备及动物免疫方案：

（1）免疫佐剂的选择：免疫佐剂优选为弗氏佐剂，初次免疫选用弗氏完全佐剂（FCA），加强免疫（二免、三免）均选用弗氏不完全佐剂（FIA），两者在母鸡血清及卵黄中诱导产生中和抗体的量上具有不同的效能。

（2）抗原免疫物的制备：初次免疫，将制备的10 mL 复合菌体蛋白抗原与等量弗氏完全佐剂（FCA）混合，采用快速乳化法，冰浴条件下，利用超声波粉碎仪反复乳化3-4 次（每次乳化10-15 s，置4 ℃冰箱，间隔1 min），直至完全乳化抗原和佐剂混合物。乳化完全后，冷藏备用。加强免疫均选用弗氏不完全佐剂（FIA）与所述复合菌体蛋白抗原等量混合、充分乳化，作为免疫抗原用于免疫产蛋母鸡，免疫效果更佳。

（3）免疫方案：制定多次交替的免疫程序，选择具有高免应答能力的健康产蛋鸡(180日龄)，采用肌肉、皮下多点注射式途径，免疫间隔设定为10日、免疫3次（基础免疫1次、加强免疫2次）、免疫接种剂量为0.50 mg的免疫方案。首免后，收集免疫鸡产下的蛋为样品，即高免鸡蛋，备用。

实施例3：

抗DP-BM-IgY的分离与纯化：

采用水稀释法－冷冻法－聚乙二醇（PEG-6000）沉淀法分离提纯抗DP-BM-IgY，分别采用4 %、12 %的PEG-6000进行纯化，以进一步去除卵黄磷脂及蛋白沉淀，脱脂、沉淀蛋白效果好，制备的抗DP-BM-IgY得率平均可达到50-60 mg/蛋，抗体纯度可达90 %以上。具体地，将高免鸡蛋用碘酒和酒精棉球进行消毒处理，分离蛋黄和蛋清（尽可能去除干净蛋黄表面的白蛋白），刺破蛋黄膜，收集无膜蛋黄液并计量体积。取卵黄液 + 去离子水以1: 6-10 的比例混合(v/v，每个鸡蛋的卵黄液平均按15 mL计)，pH 值调至5.0-6.0，－20 ℃过夜（约8-10 h），4 ℃解冻，将析出的上清液及卵黄沉淀于4 ℃条件下离心（8000-10000 rpm，10 min左右），弃去脂肪沉淀。收集上清液，根据上清液的体积加入4 % 的PEG-6000 (w/v)，轻轻搅拌使其完全溶解，4 ℃静置2-3 h，混合液在4 ℃条件下离心（8000-10000 rpm，10 min左右），以进一步去除卵黄中的磷脂（离心后的黄色沉淀主要是蛋黄中的磷脂，蛋白主要存在上清液中）。收集上清液，根据上清液的体积加入12 % 的PEG-6000 (w/v)，轻轻搅拌使其完全溶解，4 ℃静置1-2 h，以沉淀其中的蛋白抗体。0 ℃、10000 rpm 的条件下离心15-20 min，使最终获得的卵黄源抗DP-BM-IgY抗体转移入沉淀中。弃上清液，用少量0.1M PBS 溶液溶解沉淀，用改良Bradford法测定其中抗DP-BM-IgY卵黄抗体的蛋白浓度，并将其浓度调节到0.5 mg/mL，转移至小管，0 ℃保存，备用。另外，抗DP-BM-IgY卵黄抗体的纯度采用SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测，如图1所示。

图1中，提取的抗DP-BM-IgY卵黄抗体蛋白质中含有少量41～44 Kda的IgY，而在标准商品化鸡IgY中位于45 Kda处的条带己被彻底除去。经软件Bandscan分析，IgY纯度可达90 %以上。其中： M—蛋白Marker；1-标准鸡IgY；2-提取的抗DP-BM-IgY。

实施例4：

包被抗DP-BM-IgY的微囊制剂的制备：

（1）微囊包被配方筛选与制备

抗DP-BM-IgY卵黄抗体液20mL；

2.0 % 的海藻酸钠（Sodium alginate, SA或NaAlG）水溶液：称取2.0 g 海藻酸钠溶于100 mL 去离子水中，用磁力搅拌器搅拌至溶解，待用；

2.0 % 的壳聚糖（Chintosam）溶液：称取2.0 g壳聚糖，加10% 醋酸搅拌溶解，加去离子水稀释至100 mL，配制成2.0 %的壳聚糖溶液（pH 为3.0-4.5），待用；

2.0 %的CaCl₂溶液：称取2.0 g 氯化钙溶于100 mL 去离子水中，搅拌至溶解，待用；

乳化剂：内含0.1-0.4 %司班-80的植物油（v/v）20 mL，优选为大豆色拉油。

1.0 %的CaCl₂溶液：称取10 g 氯化钙溶于1000 mL 去离子水中，用磁力搅拌器搅拌至溶解，待用；

（2）制备过程：

将抗DP-BM-IgY卵黄抗体液2 mL（其中含1.0 g的抗DP-BM-IgY）分别缓慢加入到100 mL、50 mL、25 mL、10 mL 2.0%的海藻酸钠水溶液中，其中，抗DP-BM-IgY卵黄抗体与海藻酸钠的质量比（m：m）分别为（1：2）、（1：1）、（2：1）、（5：1）的比例进行。最佳药载质量比优选为m：m = 1：2-1，即最佳投药量范围优选为20-40 mg/mL。加入0.5 %的乳化剂大豆色拉油，在37 ℃、400 rpm磁力搅拌的作用下，均质乳化15 min（形成均匀浑浊乳状液）。

成囊反应采用挤压法，将抗DP-BM-IgY卵黄抗体液与海藻酸钠水溶液的均质乳化液，通过注射器挤压滴入到2.0 %的CaCl₂溶液中进行包被（包被搅拌速率为100-150 rpm），4号针头距液面10 cm左右，滴加速度30 滴/min左右，形成海藻酸钙微球。反应完成后，静置固化30 min。去除上清液，将微球用1.0 %的CaCl₂溶液洗涤，再与2.0 % 的壳聚糖溶液反应，充分混合，进一步固化30 min。将微球用去离子水清洗过滤，自然干燥或冷冻干燥，制得平均粒径约为1-1.5 mm的、包被有抗DP-BM-IgY的卵黄抗体微囊产品，如图2所示。

实施例5：

抗DP-BM-IgY微囊在模拟胃液中的稳定性：

模拟人工胃液的配制：将浓度2.0 g/L的NaCl溶液，用HCl调pH 值至2.0，取3.3 g胃蛋白酶加入其中，使之充分溶解，即得。

取抗DP-BM-IgY微囊10 mg，加入10 mL模拟胃液中，在恒温摇床上震荡混匀2 h（37℃，100-150 r/min）。每隔0.5 h取上清滤液500 µL，同时补充等量同温的模拟胃液，采用BCA蛋白质定量ELISA试剂盒，按改良Bradford法测定其中蛋白质的浓度，由此计算抗体释放的百分含量。

实施例6：

抗DP-BM-IgY微囊在模拟肠液中的稳定性：

模拟人工肠液配置：取磷酸二氢钾6.8 g，加水500 mL溶解，用0.1 mol/L NaOH 溶液分别调节pH 至7.4，取胰酶10 g，加水使之溶解，将两液混合后，加水稀释至1000 mL，即得。

将实施例5中经模拟胃液处理2 h的抗DP-BM-IgY微囊，滤出，用PBS液或生理盐水洗涤3次，再放入模拟肠液中，在恒温摇床上震荡混匀4 h（37℃，100-150 r/min）。每隔1.0 h取液500 µL，同时补充等量同温的模拟肠液。所取样液在4 ℃、8000-10000 rpm的条件下离心10 min，取上清，采用BCA蛋白质定量ELISA试剂盒，按改良Bradford法测定其中蛋白质的浓度，由此计算抗体释放的百分含量。

实施例5及实施例6体外释放率结果如图3所示。

在模拟人工胃液中，抗DP-BM-IgY微囊在前1 h内的释放量很少，在第1-2 h时间段，释放率有所增加，抗DP-BM-IgY微囊在模拟人工胃液2 h内未完全溶解，最大累积释放率为8.81%。结果证明，以壳聚糖-海藻酸钠作为包被材料制得的抗DP-BM-IgY微囊可有效抵御pH 2.0的胃酸作用及胃内微生物的降解，使得胶囊中的抗体仍可维持较高活性，并对胃蛋白酶有较好的抵抗力而不至于崩解。

在模拟人工肠液中，抗DP-BM-IgY微囊在10 min后开始崩解并进行释放，并在60 min内呈现快速释放的突释状态，在第1 h期间释放率达到最高，随后3 h释放量缓慢下降，逐渐趋于平稳，进入缓慢释放的状态，在模拟肠液中4 h，可基本释放完全，其4 h的累积释放率大于90%。表明抗DP-BM-IgY微囊对胰蛋白酶十分敏感，可在小肠中快速、持续的释放，具有肠溶性。

实施例7：

抗DP-BM-IgY微囊膨胀率的测定，如表1所示：

将少量包被有抗DP-BM-IgY的卵黄抗体微囊（平均粒径约1.5 mm），分别置放于模拟人工胃液、模拟人工胃液和生理盐水中，浸泡3 h，记录观察微囊在其中开始膨胀的时间，不同时间取出一定数量的微囊测定直径，并计算平均值及其膨胀度。

表 1

其中，/ 表示微囊粒径未见膨胀、

实施例8：

抗DP-BM-IgY微囊制剂的小鼠急性毒性试验：

（1） 试验动物

昆明系清洁级小鼠60只，小鼠体重20.0～22.0 g，雌雄各半，雌性小鼠未产未孕。饲养条件：试验清洁级颗粒鼠粮（苏饲审（2008）01008），室内温度22±2 ℃，相对湿度为30 %～60 %，自由采食与饮水。连续观察1周，临床健康即可用于试验，试验期间按常规饲养。

（2） 受试药及给药剂量

将实施例3制备获得的抗DP-BM-IgY卵黄抗体，用生理盐水进行稀释，获得浓度为50 mg/mL的受试药物，备用。

（3） 试验方法

实验前对小鼠进行7 d的喂养观察，每天观察记录小鼠的饮食状况、精神状态、行为活动、皮毛状况、临床症状等变化。每日空腹称重，淘汰自然死亡的小鼠。正式试验时将健康小鼠随机分成5个给药组和1个空白对照组，每组10只，雌雄各半，并对每只小鼠进行称重。灌胃前8 h、灌胃后4 h禁食，但可自由饮水。

给药组根据小鼠体质量，按照0.50、0.70、0.98、1.37、1.92 mg/g的药物剂量计算给药量，以等浓度口服液经口灌喂给药，每日最大灌胃量不超过1.0 mL/只。空白对照组不给药。试验期间所有小鼠自由采食与饮水。

（4） 观察指标

给药后3 h内，每隔30 min观察1次小鼠的健康状况、中毒表现及死亡过程，包括采食饮水、行为及反应、自主活动、呼吸急促或放缓状态、被毛松散度、症状起始时间和持续时间、死亡等情况；之后，每隔2 h观察1次；2 d后，每天观察6次，连续观察7 d。

组织病理学检查：实验期间对死亡小鼠及时进行解剖并记录病变情况，尤其是其肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、肠道、胃的病理变化，包括各脏器的外观形态颜色、大小、质地，胃肠发明是否出现腹部胀气，并观察大便性状和色泽。第8天，对所剩存活小鼠进行称重、断颈处死，剖检观察、记录腹腔内的液体状况以及心、肝、脾、肺、肾的病理变化。

（5） 试验结果与分析

小鼠行为学的影响

给药灌胃后，小鼠有短暂的精神沉郁、活动量减少的现象，未见其他明显的异常反应。灌胃后第2～3 d，小鼠饮食、饮水量均有一定程度的增加，活动增多，精神状态良好，未出现异常反应。试验过程中小鼠自由采食与饮水，经称重，各药物组及对照组小鼠的体质量在第7 d试验结束时，体质量均有一定程度的增加，存活的小鼠体质量均在30 g以上，在观察期间未见死亡，未出现毒性反应。

小鼠剖检检查结果显示，各药物组小鼠的主要组织器官正常，脏器无实质性异常变化。

本方法选用的弗氏佐剂（FIA和FCA）购于美国Sigma 公司；壳聚糖（Chintosam）购于国药集团化学试剂有限公司；海藻酸钠（Sodium alginate, SA或NaAlG）购于天津市光复精细化工研究所；无水氯化钙（分析纯，CaCl₂）购于天津市百世化工有限公司。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。