本发明涉及一种个体识别和亲权鉴定的方法和系统，尤其涉及一种对未知猪检材进行个体识别和亲权鉴定的方法和系统。
背景技术：
：微卫星标记(microsatellite)，又称短串联重复序列(shorttandemrepeats,STRs)或简单重复序列(simplesequencerepeats),是指重复单位长度为2-6个碱基的重复序列。由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此STR是目前法医DNA分析中最常用的一类遗传标记。法医DNA分析技术除了对人类进行DNA分析外，还可对动物进行种属鉴定、个体识别及亲权关系鉴定。猪是我国农村常见的家畜，随着人们对亲子鉴定技术了解的加深，越来越多的民事及刑事案件中要求对猪进行亲子鉴定和个体识别，另外养猪业也是我国畜牧业和农村支柱产业的重要组成部分，种属分析在猪育种方面也具有重要的作用。专利CN102154280A中公开了一种猪微卫星标记的复合扩增的方法及其专用引物。其选取了10个二核苷酸重复序列，分别为：SW240，SW951，SW857，S0155，S0386，SW902，S0255，S0101，S0227，S0355，构建了十重复合扩增体系，为四色荧光检测系统。但是，上述位点均为二核苷酸重复序列，分型结果中stutter峰比较严重，并且部分位点遗传多态性较差，并且存在累积个体识别率较差的问题。如何提供一种可解决上述问题的检测方法和系统成为有待解决的问题。技术实现要素：本发明提供了一种对未知猪检材进行个体识别和亲权鉴定的方法，能获得未知猪检材包括12个常染色体STR基因座、以及性别决定基因座PigSTRAM在内共13个基因座的分型结果，从而实现对未知猪检材的个体识别和亲权鉴定。本发明还提供一种对未知猪检材进行个体识别和亲权鉴定的系统，通过该系统可以实现对未知来源个体针对上述13个基因座的准确分型，从而对未知猪检材进行个体识别和亲权鉴定。本发明还提供了一种复合检测体系，所述检测体系能准确获得未知猪检材包括12个常染色体STR基因座和性别决定基因座PigSTRAM在内共13个基因座的分型结果。本发明还提供了一种检测试剂盒，包括所述的复合检测体系。本发明提供的一种对未知猪检材进行个体识别和亲权鉴定的方法，该方法包括：1)提取未知猪检材的DNA；2)获得所述DNA包括12个常染色体STR基因座、以及性别决定基因座PigSTRAM在内共13个基因座的分型结果，所述12个常染色体STR基因座为SW240、PigSTR13E、PigSTR15A、S0655、PigSTR11B、PigSTR14A、387A12F、PigSTR4C、PigSTR17A、PigSTR5C、PigSTR7B和S0386；3)根据未知猪检材13个基因座的基因型进行个体识别和亲权鉴定。在本发明的方案中，所述13个基因座是申请人通过对大量猪个体的生存环境、种族起源等进行综合分析获得的。所述未知猪检材可以为来自猪的血液、组织等样本，这些样本的个体来源未知。在本发明的一个具体实施方式中，所述2)包括采用与所述13个基因座一一对应的13对扩增引物对其进行扩增以获得扩增产物的步骤；所述扩增引物为序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.26的核苷酸序列。在本发明的另一个具体实施方式中，其中2)还包括在获得扩增产物后，使用遗传分析仪分析该扩增产物，以获得所述13个基因座的基因型的步骤。在本发明的方案中，所述遗传分析仪可以是本领域技术人员常规使用的遗传分析仪，例如ABI3130或ABI3500型遗传分析仪，通过ID-X软件或其他GeneMapper软件等分析该PCR扩增产物中所述13个基因座的基因型。本发明提供的一种对未知猪检材进行个体识别和亲权鉴定的系统，所述系统包括DNA提取体系，复合检测体系，以及推断体系；所述DNA提取体系用于提取未知猪检材的DNA；所述复合检测体系用于获得所述DNA包括12个常染色体STR基因座、以及性别决定基因座PigSTRAM在内共13个基因座的分型结果，所述12个常染色体STR基因座为SW240、PigSTR13E、PigSTR15A、S0655、PigSTR11B、PigSTR14A、387A12F、PigSTR4C、PigSTR17A、PigSTR5C、PigSTR7B和S0386；所述推断体系用于根据未知猪检材13个基因座的基因型进行个体识别和亲权鉴定。在本发明的一个具体实施方式中，所述复合检测体系用于采用与所述13个基因座一一对应的13对扩增引物对其进行扩增以获得扩增产物，所述扩增引物为序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.26的核苷酸序列。更进一步的，所述复合检测体系还用于在获得扩增产物后，使用遗传分析仪分析该扩增产物，以获得所述13个基因座的基因型。更进一步的，所述遗传分析仪利用针对各基因座的等位基因的分型标准物来确定未知猪检材DNA中各基因座的基因型。本发明提供的一种复合检测体系，所述体系包括未知猪检材DNA，13个基因座，以及扩增引物，所述复合检测体系用于获得所述DNA包括12个常染色体STR基因座、以及性别决定基因座PigSTRAM在内共13个基因座的分型结果，所述12个常染色体STR基因座为SW240、PigSTR13E、PigSTR15A、S0655、PigSTR11B、PigSTR14A、387A12F、PigSTR4C、PigSTR17A、PigSTR5C、PigSTR7B和S0386；所述扩增引物由与所述13个基因座一一对应的13对扩增引物组成，所述扩增引物为序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.26的核苷酸序列。在本发明的方案中，所述DNA聚合酶可以是FastStartDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、HotstartDNA聚合酶中的一种或多种。本发明还提供了一种检测试剂盒，包括所述的复合检测体系。在本发明的方案中，本发明利用所述复合检测体系进行13个基因座的分型的方法，包括：1)将提取的未知猪检材DNA作为模板；2)使用所述扩增引物对作为模板的未知猪检材DNA进行多重PCR扩增反应以得到扩增产物；3)将所述扩增产物利用遗传分析仪进行分析，以获得13个基因座的分型结果。在本发明的方案中，所述13个基因座信息如表1所示：表1本发明提供的优选扩增引物序列如下。所述13对扩增引物及其相对应的基因座如下表2所示，PCRU代表上游引物，PCRL代表下游引物；表2本发明方案具有以下的优点：1、本发明的检测方法和检测系统采用特定的STR基因座组合中二核苷酸重复序列2个，四核苷酸重复序列10个，性别决定基因座1个，减少了现有检测系统的检测结果中存在严重的stutter峰的问题。2、本发明的检测方法和检测系统采用特定组合的13个基因座，解决了现有检测系统中遗传多态性差及累积个体识别率和累积非父排除率不高的问题。3、本发明的方案可以通过使用荧光标记，利用常规的遗传分析仪，根据所要扩增的基因的分子量和荧光颜色的不同，获得直观的检测结果，并且该结果与现有检测系统相比，准确性为100％。4、本发明提供的方案能有效从基因水平实现对未知猪个体来源的推断，为其个体识别及亲权关系鉴定提供准确的科学依据。具体实施方式以下实施例中使用的100份猪抗凝血(雄性53份，雌性47份)，由公安部物证鉴定中心提供；在240例猪的无关个体来自公安部物证鉴定中心。以下实施例中使用的方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂耗材和仪器如下表3所示：表3实施例1、对本发明的对未知猪检材进行个体识别和亲权鉴定的方法和系统准确性的验证在本实施例中，所述未知猪检材为100份猪抗凝血(雄性53份，雌性47份)，已知其个体来源，但在本申请实施例1的实施过程中设定其个体来源未知，采用本申请方法和系统对其进行个体识别和亲权鉴定，包括：1)利用本发明的系统中的DNA提取体系提取未知猪检材的DNA，2)利用本发明的系统中的复合检测体系获得所述DNA包括12个常染色体STR基因座以及性别决定基因座PigSTRAM在内共13个基因座的分型结果，3)利用本发明的系统中所述推断体系，根据未知猪检材13个基因座的基因型进行个体识别和亲权鉴定。本实施例中，所述复合检测体系包括未知猪检材DNA，13个基因座，以及扩增引物，所述复合检测体系用于获得所述DNA包括12个常染色体STR基因座、以及性别决定基因座PigSTRAM在内共13个基因座的分型结果，所述12个常染色体STR基因座为SW240、PigSTR13E、PigSTR15A、S0655、PigSTR11B、PigSTR14A、387A12F、PigSTR4C、PigSTR17A、PigSTR5C、PigSTR7B和S0386；所述扩增引物由与所述13个基因座一一对应的13对扩增引物组成，所述扩增引物为序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.26的核苷酸序列。1、提取待检测的100个样本的DNA作为模板采用QIAampDNABloodMidi试剂盒(QIAGEN公司，德国)分别提取上述100个样本的DNA，使用NanoDrop2000cSpectrophotometer(Thermo公司，美国)进行定量。提取DNA步骤和定量步骤按照试剂盒说明书进行。2、利用所述复合检测体系进行13个基因座的分型，包括：将提取的未知猪检材DNA作为模板；使用所述扩增引物对提取的DNA模板进行多重PCR扩增反应，以获得扩增产物；将扩增产物利用遗传分析仪确定13个基因座的分型结果。具体过程如下：2.1、引物池配置扩增引物池的配置，其中所述扩增引物中为所述13个基因座一一对应的13对扩增引物，本实施例中，优选的，所述13个基因座的扩增引物为序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.26的核苷酸序列；本发明提供的各种引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成好的引物用1×TE缓冲液稀释到100μM，将13个基因座的上下游引物等比混合，得到浓度为50μM的引物。从13管PCR引物中分别取不同体积加入到一个新的离心管中，作为13重PCR引物池，引物池中针对各STR位点的引物的终浓度如下表4所示：表4基因座基因座终浓度(μM)SW240SW2400.5PigSTR13E13E0.5PigSTR15A15A0.3S0655S06550.4PigSTR11B11B0.4PigSTR14A14A0.3387A12F12F0.3PigSTR4C4C0.4PigSTR17A17A0.3PigSTR5C5C0.5PigSTR7B7B0.3S0386S03861PigSTRAMAmelogenin0.32.2、多重PCR反应本实施例使用9700型PCR扩增仪进行多重PCR反应。(1)配置PCRmix(25μL体系)，如下表5所示。表5试剂名称浓度PCR引物池12.5μLTris-HCl20mMKCl50mMMgCl21.6mM牛血清白蛋白0.8mg/mlTween-200.2％甘油3.2％NaN30.02％dNTP200μMTaq酶2U未知猪检材DNA模板(1ng/μL)1μL总计25μL(2)扩增程序PCR扩增过程的热循环参数为：①95℃，11min；②28个循环，每个循环94℃1min，60℃1min，72℃1min；③72℃，60min；④25℃，保温。2.3、PCR产物分型待分型样品的准备：1.电泳上样混合物的准备，按下面比率准备内标和去离子甲酰胺组成上样混合物：10μlTyper500内标+1000μl去离子甲酰胺，混合均匀。2.每管加入10μl上样混合物、1μl扩增产物，混匀。3.95℃变性3分钟，立即放在冰上冷却3分钟，之后电泳。ABI3130XL型遗传分析仪上进行检测。应用ABI3130XLDateCollectionSoftware3.1收集数据，GeneMapper3.3软件对电泳结果进行分析，获得所述13个基因座的基因型。2.4、结果分析为了验证分型结果的准确性，从100份DNA样品中随机抽取50份DNA样品，对13个基因座进行测序(北京迈奥德恩生物科技有限公司测序)，采用本实施例的复合检测体系获得的所有的分型结果与测序结果均一致，一致性达到100％，此结果证本发明复合检测体系分型结果准确。3、根据未知猪检材13个基因座的基因型进行个体识别和亲权鉴定由本实施例方法获得的上述100份检材的个体来源和亲权鉴定结果，与其已知的个体来源和亲权鉴定结果一致，说明本发明方法可以对未知猪检材的个体识别和亲权鉴定。实施例2本发明检测系统的累积个体识别率和累积非父排除率分析采用本发明系统按照实施例1所述方法获得240例猪的无关个体的分型结果，并计算这些结果中针对12个常染色体STR基因座，中国猪的个体识别率、杂合度、多态性信息含量、非父排除率以及匹配概率。具体的，采用Powerstatsv1.2软件计算个体识别率(DP)、杂合度(H)、多态信息含量(PIC)、非父排除率(PE)、匹配概率(Pm)，如下表6所示。并根据以下公式1-2计算累积非父排除率和累积个体识别力。表6DPHPICPEPm4C0.9090.6420.740.3440.0915C0.9000.6330.750.3330.1007B0.9160.6830.740.4030.08411B0.8000.5130.610.1990.20012F0.9720.7950.900.5900.02813E0.8550.5060.640.1930.14514A0.8520.5830.630.2710.14815A0.9550.5750.880.2620.04517A0.9360.6960.790.4220.064S03860.9500.6960.830.4220.050S06550.9220.3330.840.0780.078SW2400.9620.7920.860.5840.038累积个体识别能力计算公式1：TDP＝1-(1-DP1)(1-DP2)(1-DP3)…(1-DPK),DPK为第k个基因座的DP值。累积非父排除率计算公式2:CEP＝1-(1-PE1)(1-PE2)(1-PE3)…(1-PEK),PEK为第k个基因座的PE值。可以看出，上述12个猪的STR基因座累计匹配概率(PM)为3.9208×10-14，累计个体识别力(TDP)为0.999999999999961，累计非父排除概率(CEP)为0.9952。而CN102154280A检测系统的累积个体识别力(TDP)和累积非父排除率(CEP)为0.99999998和0.9921。可以看出，本申请的检测系统大大提高了对猪检材的个体识别率，解决了现有检测系统累积个体识别率和累积非父排除率不高的问题。当前第1页1 2 3