本发明属于农业生物
技术领域：
，具体涉及纳米材料处理的生菜内参基因的筛选及其应用。
背景技术：
：生菜(LactucasativaL.cv.Italian)，学名叶用莴苣，属于菊科莴苣属蔬菜作物，在世界各地广泛栽培。本研究通过对纳米材料处理水培生菜转录组的分析，探索参与纳米材料调控生菜生长的关键基因，分析纳米材料对植物生长发育的影响的调控机制。基于转录组测序比较纳米材料处理的生菜的基因表达差异的研究过程中，较多的涉及到应用q-PCR验证和分析基因表达模式和水平，因此筛选纳米材料处理下稳定表达的内参基因对q-PCR结果起着关键作用。目前，在菊科作物上常用的内参基因有3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、18s核糖体RNA(18sRNA)、肌动蛋白基因(Actin)、多聚泛素酶基因(UBQ)和转录延伸因子基因(EF1)等。我们采用RNA-Seq技术研究了纳米材料处理的生菜的基因表达谱，采用q-PCR验证基因表达水平，以18sRNA作为内参基因，发现18sRNA表达会受到纳米材料处理影响较大。因此，本研究目标是基于RNA-Seq基因表达谱数据，筛选稳定性好的内参基因，用于纳米材料处理的相关基因的表达研究。技术实现要素：为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供几种基于RNA-Seq挖掘纳米材料处理的生菜基因表达谱中稳定表达的基因，以其作为纳米材料处理的生菜内参基因。通过研究不同纳米材料处理时间、不同组织样品中候选内参基因表达情况，得到纳米材料处理的生菜基因表达水平分析所需的稳定、可靠的内参基因，为生菜的基因表达研究提供更好的内参基因。本发明的一个目的在于提供上述纳米材料处理的生菜内参基因的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：纳米材料处理的生菜内参基因，其为生菜肌动蛋白actin基因(LsActin)、肌动蛋白actin2基因(LsActin2)、肌动蛋白actin3基因(LsActin3)、CAB基因(CAB10253.1亚型1，LsCAB)、转录延伸因子EF1基因(LsEF1)、WD重复域磷脂结合蛋白3基因(LsWD)。所述的肌动蛋白actin基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述的肌动蛋白actin2基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；所述的肌动蛋白actin3基因的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；所述的CAB基因的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；所述的转录延伸因子EF1基因的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；所述的WD重复域磷脂结合蛋白3基因的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示。所述的纳米材料处理的生菜内参基因在纳米材料处理的生菜内参基因的表达分析或研究中的应用。用于扩增纳米材料处理的生菜内参基因的q-PCR引物。所述的q-PCR引物为：表16个生菜内参基因的引物序列所述的q-PCR引物在纳米材料处理的生菜内参基因的表达分析或研究中的应用。上述内参基因用于纳米材料处理的生菜基因表达的q-PCR分析。本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：本发明首次针对纳米材料处理的生菜研究借助RNA-Seq数据对内参基因进行筛选，有利于提高纳米材料处理的生菜的基因表达分析研究的稳定性和可靠性。附图说明图1是供试纳米胶片。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1纳米材料处理下生菜内参基因的筛选(1)通过筛选生菜在正常生长条件和纳米处理后共4个样本(CK-leaf、CK-root、T-leaf、T-root)的36919个Unigene的RPKM值，得到了6个表达稳定的Unigene作为候选内参基因(表2)。表2RNA-Seq中代表各Unigene表达水平的RPKM值内参基因GeneIDCK-leaf_RPKMCK-root_RPKMT-leaf_RPKMT-root_RPKMLsActinUnigene001016432.7607987150.7886071847.784592345.76762323LsActin2Unigene001016042.2433266457.1419951555.9745922843.12085791LsActin3Unigene001549428.9947377937.613446923.8329808723.39265286LsCABUnigene001042733.9258117721.6874981236.4207409139.69511812LsEF1Unigene002009615.9181836311.9687836414.9867575213.77052351LsWDUnigene002641523.8411702534.8041009525.3685500328.95440767(2)以正常生长条件和纳米材料处理下的不同时间、不同组织待检生菜cDNA为模板，使用上述q-PCR引物(见表1)对其进行q-PCR扩增；(3)对q-PCR反应后得到的Ct值，使用GeNorm、NormFinder和Bestkeeper等软件进行各候选内参基因稳定性进行分析，获得纳米材料处理下稳定表达的生菜内参基因。实施例2候选内参基因在纳米材料处理下不同时间生菜叶片中表达稳定性分析：(1)以意大利耐抽薹生菜(LactucasativaL.cv.Italian)为植物材料，购自广东省农业科学院蔬菜研究所；试验用泡沫箱的内体积为92cm×53cm×8cm；营养液大量元素配方采用1/2霍格兰配方(pH值≈6.2)，微量元素为通用配方。供试纳米胶片为广州市富洋环保科技有限公司和华南农业大学新肥料研究资源中心研制生产，如图1所示，主要成份是TiO2和ZnO，涂布于塑料片上，面积为14cm×12cm。(2)试验按照是否使用纳米胶片共设2个处理：CK：0片纳米胶片(0cm2·L-1)；T：1/2片纳米胶片(2.80cm2·L-1)。每个处理3次重复，每个重复18株，随机排列。2015年10月13日采用海绵块育苗，11月2日3叶1心时选用均匀一致的生菜幼苗移栽至装入30L全营养液。缓苗3d后，将1/2片纳米胶片置入泡沫箱中，直至采收。在处理后的第5d、10d、16d、22d、28d时分别取样。(3)采用Trizol试剂(Invitrogen)进行RNA提取，使用PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)试剂盒(Takara)进行反转录。将产物稀释5倍后作为PCR扩增的模板。表达分析采用相应的引物组合，进行实时定量PCR反应，试剂为PremixExTaqTM试剂盒(Bio-RAD)。2×SYBRMix5μL，正向引物(5μΜ)0.5μL，反向引物(5μΜ)0.5μL，cDNA4μL。反应程序：94℃，3min，[94℃20s，56℃20s，72℃20s]×40个循环；溶解曲线程序：65℃加热至90℃，5s。每次反应三次重复。PCR完成后，经自动分析，查看每个基因的扩增情况，导出相应的域值循环数(cycleatthreshold)，即Ct值，详见表3。表3候选内参基因不同时间纳米材料处理与对照生菜叶片的平均Ct值(4)对荧光定量PCR反应后得到的Ct值，使用GeNorm、Bestkeeper和Normfinder软件进行各候选内参基因稳定性进行分析。GeNorm软件计算每个候选基因表达稳定度M值，M值越高，表达越不稳定。NormFinder软件结合组内方差与组间方差计算出各候选内参基因稳定值，该值越小，表明内参基因越稳定。Bestkeeper可以直接输入Ct值，通过计算标准偏差和变异系数值的大小比较各内参基因的稳定性，标准差和变异系数越小，稳定性越好。从表4可见，基于RNA-Seq得到的6个候选内参基因在生菜纳米材料处理不同时间的表达稳定性最优为LsCAB。表4候选内参基因在不同时间纳米材料处理与对照生菜叶片的表达稳定性实施例3候选内参基因在纳米材料处理生菜不同组织中表达稳定性分析。(1)分别以生菜纳米材料处理及对照的根和叶作为实验材料。(2)提取RNA，反转录，进行qPCR分析。得到的Ct值如表5：表5候选内参基因不同组织纳米材料处理与对照生菜叶片的平均Ct值(3)对荧光定量PCR反应后得到的Ct值，使用GeNorm、Bestkeeper和Normfinder软件进行各候选内参基因稳定性进行分析，结果如表6。从表6可见，6个候选内参基因在不同组织中表达稳定性最好的是LsCAB。表6候选内参基因在不同组织纳米材料处理与对照生菜叶片的表达稳定性实施例4候选内参基因在纳米材料处理生菜不同时间、不同组织表达稳定性的综合分析。对GeNorm、NormFinder、Bestkeeper法分析得到的稳定性排名采用ReFinder软件求几何平均值，得到综合指数排名，该指数越小，说明内参基因表达越稳定。6个候选内参基因生菜在不同时间、不同组织表达稳定性综合排名如表7。从表7可见，基于RNA-Seq数据开发得到的6个候选内参基因，就不同处理时间而言，排名前3的内参基因为LsCAB、LsEF1和LsActin3；对纳米处理下不同组织而言，排名前3的内参基因也是LsCAB、LsEF1和LsActin3；适用于纳米材料处理下不同时间处理、不同组织样品基因表达分析最佳的内参基因是LsCAB，其次是LsEF1和LsActin2。表7候选内参基因的综合排名处理及排名ActinActin2Actin3CABEF1WD不同时间5.053.082.991.412.004.61排名643125不同组织3.984.233.571.001.865.42排名453126所有样品3.763.464.161.001.866.00排名435126上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3