重组人MEN1小基因及其无义突变体稳定细胞株的制作方法

本发明涉及细胞工程和基因工程技术，具体涉及一种重组人MEN1小基因及其无义突变体稳定细胞株的建立方法和依照该方法建立的重组人MEN1小基因及其无义突变体稳定细胞株。

背景技术：
：

基因的无义突变在细胞内产生了含有提前终止密码子(premature translation termination codon，PTC)的异常mRNA。这些含有PTC的mRNA在第一轮翻译过程中被细胞内的无义突变介导的mRNA降解途径(nonsense-mediated mRNA decay，NMD)所识别和降解，从而消除这种mRNA翻译产生的截短的、有毒的蛋白质对机体的危害。NMD途径是一种重要的真核生物基因转录后监督机制，是基因表达的翻译调控。研究发现，许多癌症和肿瘤的致病原因是由于无义突变导致抑癌基因表达水平严重降低或缺失。因此，抑癌基因无义突变及其翻译调控的研究，有助于揭示基因突变引发癌症的发病机制。

多发性内分泌腺瘤I型(multiple endocrine neoplasia type 1，MEN1)是一种常染色体显性遗传紊乱性疾病，以甲状旁腺、胰岛细胞和垂体前叶三种内分泌腺肿瘤的联合发生为特征。一些病人也可能发展成为肾上腺皮层肿瘤、类癌瘤、血管纤维瘤、胶原瘤和脂肪瘤。抑癌基因MEN1由10个外显子构成，其编码区域长1830bp，编码了一个包含610个氨基酸的蛋白，即Menin蛋白。分子生物学研究已经证实近乎10％的MEN1病人的MEN1基因发生了无义突变。

目前国内外尚无一细胞株可用于筛选由于无义突变导致的多发性内分泌腺瘤病的治疗药物，因此急需建立相应的细胞株以供体外筛选由于无义突变导致的多发性内分泌腺瘤病及其它肿瘤的潜在治疗药物。

技术实现要素：
：

本发明的目的在于提供一种重组人MEN1小基因及其无义突变体的稳定细胞株，该细胞株可用于筛选由于无义突变导致的肿瘤及其它疾病的治疗药物。

本发明提供的一种重组人MEN1小基因，含有BamHⅠ序列(6bp)、外显子2+内含子2+外显子3+内含子3+外显子4+内含子4+外显子5(2928bp)、EcoRⅠ序列(6bp)、外显子6+内含子6+外显子7+内含子7+外显子8+内含子8+外显子9+内含子9+外显子10(2762bp)、HindⅢ序列(6bp)；其中7～448、2014～2222、2433～2561、2894～2934、2941～3028、3671～3807、4269～4404、4841～5005、5223～5702为外显子；其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

本发明提供的四种重组人MEN1小基因无义突变体，其是由所述的重组人MEN1小基因通过PCR定点突变技术分别将其核苷酸序列中424位由C突变为T(M1)、3697位由T突变为A(M2)、3697位由T突变为G(M3)、4906位由C突变为G(M4)。

本发明提供的一种稳定细胞株，其含有上述重组人MEN1小基因。

本发明提供的四种稳定细胞株，其分别含有上述重组人MEN1小基因无义突变体M1、M2、M3、M4。

本发明提供的一种稳定细胞株的建立方法，包括如下步骤：

1)利用基因重组技术将人MEN1小基因克隆到含有c-myc标签和HA标签的哺乳动物表达载体pcDNA3.1(-)中，构建成pCMV-MEN1；

2)利用PCR定点突变技术，分别得到424位由C突变为T、3697位由T突变为A、3697位由T突变为G、4906位由C突变为G，人MEN1小基因无义突变质粒pCMV-MEN1-M1、pCMV-MEN1-M2、pCMV-MEN1-M3、pCMV-MEN1-M4；

3)培养HeLa细胞，培养液为DMEM，添加10％胎牛血清，不添加抗生素培养，0.25％胰蛋白酶消化细胞，按2×10⁵cell/mL密度种于6孔细胞培养板；

4)利用Attractene Transfection Reagent将质粒pCMV-MEN1、pCMV-MEN1-M1、pCMV-MEN1-M2、pCMV-MEN1-M3、pCMV-MEN1-M4分别转染HeLa细胞，24hr后，胰酶消化细胞，按照1：10稀释种于6孔细胞培养板中，培养基中加入G418(终浓度为400μg/mL)筛选，每2～4天更换一次含有G418的培养液；

5)G418筛选15～20天，6孔板出现细胞克隆团，挑取细胞克隆团通过RT-PCR鉴定，阳性克隆采用有限稀释法在96孔板中进行单克隆化培养；

6)待96孔板中单细胞长至汇合度80％以上，进行传代培养，并通过RT-PCR进行鉴定；

7)RT-PCR鉴定为阳性单克隆，扩大培养，提取基因组，进行PCR鉴定，最终获得五种稳定细胞株HMEN1-WT、HMEN1-M1、HMEN1-M2、HMEN1-M3和HMEN1-M4；

8)将上述五种细胞株冻于液氮中保藏。

本发明的有益效果：

本发明建立的稳定细胞株HMEN1-WT基因组整合野生型的人MEN1小基因；HMEN1-M1、HMEN1-M2、HMEN1-M3、HMEN1-M4分别整合MEN1小基因的无义突变体M1、M2、M3、M4。本发明建立的上述五种稳定细胞株，可用于无义突变导致肿瘤的治疗药物的筛选。

附图说明：

图1是重组人MEN1小基因结构示意图。该小基因含有BamHⅠ序列(6bp)、外显子2+内含子2+外显子3+内含子3+外显子4+内含子4+外显子5(2928bp)、EcoRⅠ序列(6bp)、外显子6+内含子6+外显子7+内含子7+外显子8+内含子8+外显子9+内含子9+外显子10(2762bp)、HindⅢ序列(6bp)。

图2是重组人MEN1小基因表达载体鉴定图。泳道1是pcDNA3.1(-)空质粒；泳道2是重组质粒pCMV-MEN1；泳道3是重组质粒pCMV-MEN1的PCR鉴定。

图3是重组人MEN1小基因转染HeLa细胞的RT-PCR鉴定图。泳道1为未转染细胞的阴性对照；泳道2为重组人MEN1小基因转染细胞。

图4是重组人MEN1小基因无义突变体测序鉴定图谱。

图5是利用实时荧光定量PCR检测重组人MEN1小基因及其无义突变体稳定细胞株mRNA表达水平。

图6是利用Western blot检测不同浓度的通读药物PTC124处理稳定细胞株后全长MEN1蛋白的表达水平。

具体实施方式

实施例1

1、重组人MEN1小基因表达载体的构建

利用BamHⅠ和HindⅢ对人MEN1小基因进行双酶切得到5.7kb的基因片段，电泳回收。含有c-myc标签和HA标签的哺乳动物高效表达载体pcDNA3.1(-)也使用BamHⅠ和HindⅢ双酶切成线性载体，电泳回收。将其与回收的人MEN1小基因片段使用T4DNA连接酶连接，得到重组质粒pCMV-MEN1，重组质粒经PCR鉴定。

2、重组人MEN1小基因无义突变体的构建

设计四对部分序列互补的突变引物，分别使424位由C突变为T(M1)、3697位由T突变为A(M2)、3697位由T突变为G(M3)、4906位由C突变为G(M4)，使用高保真酶以重组质粒pCMV-MEN1为模板进行PCR扩增，产物经DpnⅠ消化模板，取10μL产物转化细菌，挑取克隆提取质粒，测序鉴定，分别得到突变质粒pCMV-MEN1-M1、pCMV-MEN1-M2、pCMV-MEN1-M3、pCMV-MEN1-M4。

3、HeLa细胞的培养与传代

细胞来源于山西大学生物技术研究所。将长期保存于液氮的HeLa细胞从冻存盒中取出，静置至细胞冻存管中液氮全部挥发；迅速在37℃的循环水浴锅中将细胞冻存液完全融化，1000×g离心5min；弃掉上清，将沉淀中的细胞用1mL新鲜的细胞培养液(含10％的胎牛血清的DMEM培养基)悬浮；吸取细胞悬液接入细胞培养瓶(25cm²)中，将培养基补到3～4mL，旋紧细胞培养瓶盖；在水平方向混匀细胞培养液，在37℃5％CO₂的二氧化碳细胞培养箱中培养细胞。待细胞汇合度达到70％以上即可传代，将细胞瓶中旧培养液弃掉，用2mL无菌PBS洗涤细胞2次；加入1mL 0.25％的胰酶，使其覆盖全部细胞，37℃消化5～7min；用1mL细胞培养液(含血清)终止胰酶的消化作用，然后将细胞从瓶壁上吹洗起来，至细胞为单个细胞；按照1：2～1：4的比例将细胞分别接种到新的培养瓶中继续培养。

4、HeLa细胞的转染及筛选

(1)转染第一天，将HeLa细胞按2×10⁵cell/mL密度种于6孔培养板中，过夜培养使得次日细胞汇合度达到90～95％。

(2)转染第二天，在1.5mL无菌离心管中按下述步骤配制质粒与转染试剂Attractene Transfection Reagent混合液，用于转染6孔板内培养的细胞。①取1.2μg质粒溶于100μL不含血清及抗生素的DMEM中；②添加4.5μL Attractene Transfection Reagent，混匀后室温静置10～15min；③将上述混合液添加至6孔板内培养细胞的培养液中混匀；④放置培养箱中继续培养24hr。

(3)转染细胞的筛选

转染24hr后，胰酶消化细胞，按1∶10稀释接种于6孔培养板中，加G418(400μg/mL)筛选，每2～4天更换一次含有G418的筛选培养液，筛选15～20天，可见培养板中出现细胞克隆团。

(4)细胞株的单克隆化及扩大培养

筛选15～20天，6孔板出现细胞克隆团，挑取细胞克隆团，采用有限稀释法在96孔培养板中进行单克隆化。96孔板中单细胞增殖过程中，用胰酶消化吹散使其重新贴壁生长，待长至80％以上，进行传代培养，并通过RT-PCR进行鉴定。对于RT-PCR鉴定阳性克隆，扩大培养，提取基因组，PCR鉴定，最终获得五种细胞稳定株HMEN1-WT、HMEN1-M1、HMEN1-M2、HMEN1-M3和HMEN1-M4，并冻存于液氮中保藏。

5、人MEN1小基因及其无义突变体在稳定细胞株中的表达

(1)人MEN1小基因的PCR

根据人MEN1小基因序列两端分别带c-myc、HA标签，设计一对特异标签引物，扩增片段大小应为5708bp。pCMV-MEN1质粒作为阳性对照，未转染的HeLa细胞作为阴性对照，以稳定细胞株HMEN1-WT、HMEN1-M1、HMEN1-M2、HMEN1-M3和HMEN1-M4的基因组DNA为模板扩增，经30个循环，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。可见两样品分别在近6000bp处有一特异条带，与阳性对照条带大小相同，而未转染的HeLa细胞基因组DNA中无扩增条带。说明MEN1小基因及其无义突变体已分别成功导入细胞内。

(2)人MEN1小基因的RT-PCR

根据人MEN1小基因序列两端分别带c-myc、HA标签，设计一对特异标签引物，扩增片段大小应为1830bp。未转染的HeLa细胞作为阴性对照，以稳定细胞株HMEN1-WT、HMEN1-M1、HMEN1-M2、HMEN1-M3和HMEN1-M4的mRNA反转录成的cDNA为模板，经30个循环，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。可见两样品分别在近2000bp处有一特异条带，而未转染的HeLa细胞中无扩增条带。说明稳定细胞株HMEN1-WT、HMEN1-M1、HMEN1-M2、HMEN1-M3和HMEN1-M4分别存在MEN1小基因和其无义突变体在转录水平的表达。

6、通读药物的筛选

用不同浓度的通读药物PTC124(0、2、10、20μM)分别处理四种无义突变体稳定细胞株48hr，用Western Blot检测全长MEN1蛋白表达情况，以β-actin为内参照。当PTC124的处理浓度为20μM时，四种无义突变体稳定细胞株中全长MEN1蛋白表达量恢复最多。

SEQUENCE LISTING

<110> 山西大学

<120> 重组人MEN1小基因及其无义突变体稳定细胞株

<130> 无案卷参考号

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5708

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ggatccgggc tgaaggccgc ccagaagacg ctgttcccgc tgcgctccat cgacgacgtg 60

gtgcgcctgt ttgctgccga gctgggccga gaggagccgg acctggtgct cctttccttg 120

gtgctgggct tcgtggagca ttttctggct gtcaaccgcg tcatccctac caacgttccc 180

gagctcacct tccagcccag ccccgccccc gacccgcctg gcggcctcac ctactttccc 240

gtggccgacc tgtctatcat cgccgccctc tatgcccgct tcaccgccca gatccgaggc 300

gccgtcgacc tgtccctcta tcctcgagaa gggggtgtct ccagccgtga gctggtgaag 360

aaggtctccg atgtcatatg gaacagcctc agccgctcct acttcaagga tcgggcccac 420

atccagtccc tcttcagctt catcacaggt tggagcccag taggtgggaa tcttatccat 480

gacccacttc ttcaaaaccc tccatggttt acagaaccct tttaagaact gtaagccttg 540

tgaggttcgg caggtgttat tttcctcttt gcagttggga aactgaagcc cagagagggg 600

aaatgatatg ccaaagtcac acacggcatg gcagggctgg aagtgaagcc tgatcacttg 660

gctccaaatc atcaacctca cctctgcccc ctcagcaccc ccacccttgc cactgaacag 720

ctacaggagt tctaagcatg agacacagag ggcggcagca gatttagggg gcaagaagat 780

gaaattgggc tgcatttgag gcagttaaac aaaataatgg ctatgaagat tttttttttt 840

tttttttttg agacagggtc tcactctgtc ccccaggctg gagtgcagtg gtgtgatcat 900

ggctcactgc agcctcagtc tccctgggct cagagatcct ccaacctcag cctcctgagt 960

agctgagagt acaggcatgc accgtggtgc tggttaattt tttgtatttt ttttgtagag 1020

atggtgtctc actatgtggc ccagactggt cttgaactct tgggctcaag tgatctgccc 1080

gcctcagtct cccaaatgct gggattacag gtgtgagcca ccgcaactgg tggcctatga 1140

aaattttttt ttttttttca gacggcgtct cactctgtcg cccaggctgg agtgcagtgg 1200

tgcaatctcg gctcactgca agctctgcct cctgctttca tgccattctc ctgcctcctg 1260

cctcagcctc ctgagtagct gggactacag gagcctgcca ccatgcctgg ctaatttttt 1320

tttggatttt tagtagagac gaggtttcac catgttagcc aggatggtct cgatctcctg 1380

acctcgtgat ccgcccgcct tggcctccca aagtgctggg attacaggcg tgagccaccg 1440

cacctggtca aaaatgtttg agacagagaa ggggcttgac ctcaaaaggc ttaagagtca 1500

gggcttgcaa agagctttgc accaagcccg gttgactggc aatcccatcc tggtgtgcca 1560

tattgagaag gaatcagagg ctgcttctca gcttagcagg aaaagagtgc agagataaat 1620

gagggttatt tgttggtggg tgtatagcca gagagtgttg gccagcgtcc tgtttttgcc 1680

attcctgttt taacctagta agtgcagtaa aatggaatcc ctaaatccat agaatatata 1740

atagagttgc agagaaagac gaggtagggc caaaggctgg gtcagctaca ggatatccag 1800

aaaggtatct tgttggacat agagggtgta aacagggaga gagtctttga acacgtggga 1860

gggaagggat ggagggatag tgggcaggag aatctgaggt tgggtcacag gcttggaaag 1920

ggagtgggag ggagtgtggc ccatcactac ctggccccct ttccccatgt taaagcacag 1980

aggaccctct ttcattacct cccccttcca caggcaccaa attggacagc tccggtgtgg 2040

cctttgctgt ggttggggcc tgccaggccc tgggtctccg ggatgtccac ctcgccctgt 2100

ctgaggatca tgcctgggta gtgtttgggc ccaatgggga gcagacagct gaggtcacct 2160

ggcacggcaa gggcaacgag gaccgcaggg gccagacagt caatgccggt gtggctgagc 2220

gggtattgtt ccctcccccc agccttgtcc ccttcatact gtagtagccc aagccaccca 2280

agggactcca ttttcttggg ccacacccct ttcttcccat caccacccac ataggaaggg 2340

aagacagaag agcccctttt cctggctgtc attccctgaa gcaggcacag ggtgggccat 2400

catgagacat aatgatctca tcccccccta agagctggct gtacctgaaa ggatcataca 2460

tgcgctgtga ccgcaagatg gaggtggcgt tcatggtgtg tgccatcaac ccttccattg 2520

acctgcacac cgactcgctg gagcttctgc agctgcagca ggtgagggct gagccaatgg 2580

ggcaggactg ggctaggcca gacttgactt gctgtgggac cctgggcagg ggcactttcc 2640

cttcctgagc ttcagcttcc cctcctggaa aaatgggtta gtaattcctg gcctggcctt 2700

tcccagggct cttgggagag tagaattgag atgtgaaatt gctttgactc cattaaaggg 2760

ctggtcccag aattttggcc cttccacatg gtgggtggtc cctgttggtt ctgaccccca 2820

cctctgcccg ataggctaag gacccgttct cctccctgtt ccgtggctca taactctctc 2880

cttcggctcc tagaagctgc tctggctgct ctatgacctg ggacatctgg aaaggaattc 2940

gtaccccatg gccttaggga acctggcaga tctagaggag ctggagccca cccctggccg 3000

gccagaccca ctcaccctct accacaaggt gggggcatct aaggagggtg cagaagggag 3060

accctaacag tggctgaggc aggggccctc atctgggcag atgagaagag aactttgtgt 3120

gttggggggt atcgcccatc cagtctcact ttgtgtcaac tgtgtgcaga atcagttcag 3180

tcagggctgt ctgaggggtg tccagggttc cccagcctgg gagtggcagg ggctgcattt 3240

gtcccctcag ccctgccttt tctgccactg cttactgtcc ttcctggagt ataacagagg 3300

tcaaatgtgg caggagcact gatgaagagg gggtgttcac ttggtgggtg taggtgggga 3360

ggagggccat tgggctgggc ttgaaagtct ttggtgatgt gtagaagagt gtctgagaaa 3420

gagaagggcc ctgagctcgg agggcaggcc ccacccctgc agtctgcccc aggcctcagc 3480

cagcagtcct gtagacccag ggaggagacc aggtagaagg gctggcagcg agtggaggtg 3540

ggagtggaga tggagaggac tccctgggat cttcctgtgg ccccttctgg gtgtgccctg 3600

gtggggcatt tgtgccagca gggcagctgg ggctgcctcc ctgaggatcc tctgcctcac 3660

ctccatccag ggcattgcct cagccaagac ctactatcgg gatgaacaca tctaccccta 3720

catgtacctg gctggctacc actgtcgcaa ccgcaatgtg cgggaagccc tgcaggcctg 3780

ggcggacacg gccactgtca tccaggagtg aggatccccc tactagggcc tgcagcctgt 3840

cctttcttcc cctccatcag tttccaacca ccctcgtcca ggactgaggc ctggctccca 3900

cgccccatcc cctttccatc cagtccctag gcagcaaggc caccattacc caggaggtag 3960

ggaccctgat taaggtgtca catctttccc tccctcccct ctcctcctaa tttttttttt 4020

ctcagaacag tctcaaatct ccaatgttta accaccatca tccagcagtg ggacttccac 4080

cctcggcccc atgcccccct cctcattctt gctttcttcc tctgggctga cccagacagc 4140

atcattttgc agtgaggacc ccacctactc ccccagcccc tgggggctcc atcccccgcc 4200

aggtccctgg ggctaccccc gatggtgaga ccccttcaga ccctacagag accccactgc 4260

tctcacagct acaactactg ccgggaagac gaggagatct acaaggagtt ctttgaagta 4320

gccaatgatg tcatccccaa cctgctgaag gaggcagcca gcttgctgga ggcgggcgag 4380

gagcggccgg gggagcaaag ccaggtgaaa ggctggagct ccagcctgtg tccagcctcc 4440

cacctggaca gggctccctt ccacaggcca tgggggctgc atgtacggga ttagggatgg 4500

caggaggaag gtggccctga gcagacagct atgttccctt ttgctataac tgaggtcctg 4560

ggcccacgtt ggacgggact gaaggtattt tagaggtttc taccctgtgc cttcagtttc 4620

atggccagac tccctccctc agctgagggg tggaggtagg gatggtacgt cctggctatg 4680

gattggcttt ataaaaggaa agaggttcta agaatgttcc caacctatgc ttaccttttc 4740

tggagccagg ggtctttgcc taggtggggg gcctggcctg tgccctctgc taaggggtga 4800

gtaagagact gatctgtgcc ctcccttccc cctcgtccag ggcacccaga gccaaggttc 4860

cgccctccag gaccctgagt gcttcgccca cctgctgcga ttctacgacg gcatctgcaa 4920

atgggaggag ggcagtccca cgcctgtgct gcacgtgggc tgggccacct ttcttgtgca 4980

gtccctaggc cgttttgagg gacaggtgag ggacagctgc acagaggtct gggcactaca 5040

ggtggtgaca gcagccacgg gcttgtcaga cttttctggc ccaggggcag catctgccca 5100

tccccttggg tgccgatggg actgagaccc cctgggtggg atgggatggc cagagcaggg 5160

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cgtggggcga ggaagcccgg gaaggccggc ggcggggccc acggcgggag tccaagccag 5340

aggagccccc gccgcccaag aagccagcac tggacaaggg cctgggcacc ggccagggtg 5400

cagtgtcagg acccccccgg aagcctcctg ggactgtcgc tggcacagcc cgaggccctg 5460

aaggtggcag cacggctcag gtgccagcac ccgcagcatc accaccgccg gagggtccag 5520

tgctcacttt ccagagtgag aagatgaagg gcatgaagga gctgctggtg gccaccaaga 5580

tcaactcgag cgccatcaag ctgcaactca cggcacagtc gcaagtgcag atgaagaagc 5640

agaaagtgtc cacccctagt gactacactc tgtctttcct caagcggcag cgcaaaggcc 5700

tcaagctt 5708