一种DNA‑Marker及其制备工艺的制作方法

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于指示核酸分子量大小的DNA Marker及其制备工艺。

背景技术：

20世纪70年代末至80年代初，由于近代生物学的不断发展，分子生物学、基因工程、DNA重组技术等的问世，基于生物遗传物质DNA为基础，从微观角度阐释生命活动规律的研发开展得如火如荼。在这些涉及核酸物质DNA的研发工作中，DNA Marker是最为广泛使用的试剂之一，它能判断和指示核酸分子量大小，用作核酸分子量标准和对核酸片段进行定量分析。

DNA Marker含有不同分子量的DNA片段，其主要用途是在核酸的琼脂糖凝胶电泳时，用来指示核酸电泳中未知片段的分子量大小。据DNA分子量标准即DNA Marker制备所涉及的技术可分为用限制性内切酶酶切质粒及噬菌体DNA和PCR技术扩增，前者的主要不足是酶切位点过多或过少，使得酶切产物DNA大小过于接近或相差太远，不能按照目的DNA片段大小设计相符的DNA片段，在特定的实验中并不能很好的指定DNA的分子质量；由于PCR扩增具有强大的扩增DNA片段的能力，利用该技术制作DNA Marker不存在技术问题。已有学者基于PCR技术扩增出100-1000bp的DNA片段，制成DL1000 Marker、利用多重PCR制备出DL1000 DNA Marker。利用PCR技术制备DNA分子量标准的关键是目的DNA片段大小的设计、模板的选择、引物设计、PCR反应条件摸索，本发明所制备的DL2000 DNA Marker制品比常规常品多设计了一条大小为1500bp的DNA片段，适宜用于分子量不高于2000bp目的DNA片段的指示，特别是利用原核微生物16S rDNA（约为1500bp）基因对其进行种属鉴定的试验中。本发明所用扩增模板序列为SEQ NO1，大小约为5900bp，可用于5kb以下，能扩增到的目标大小DNA片段的扩增。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于指示核酸分子量大小的DNA Marker及其制备工艺

本发明所提供的DL2000 DNA Marker是由2000 bp、1500bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp以及 100 bp共 7 条双链DNA片段组成，已混有上样缓冲液，可直接用于凝胶电泳，每次上样5μl；为便于电泳后观察，1000bp条带最亮，约为100ng，其它约为50ng；用作指示核酸电泳中未知大小DNA片段的分子量大小。

本发明所提供的DL2000 DNA Marker的制备工艺是以质粒SEQ No.1为模板，设计一条上游引物和7条下游引物，利用PCR扩增大小分别为2000 bp、1500bp、1000 bp、750 bp、500 bp、 250 bp以及 100 bp的DNA片段，测定扩增产物含量并进行DNA片段配方优化，最后得到按照目的DNA条带大小设计的、经电泳及染色后条带清晰，密度适宜的DL2000 DNA Marker。

引物的设计与合成

通过参照质粒SEQ No.1的序列DNA序列，结合Ediseq和PrimerSelect软件设计1个上游引物和7个下游引物，并送生物公司进行合成。其序列见表1：

表1 制备DNA Marker所用引物序列。

菌种的活化及质粒提取

菌种的活化：将JM109(SEQ No.1)甘油菌接至LB液体培养基中，于37℃140rpm过夜振荡培养8-10小时。用已活化的菌种均匀涂布在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12h后，挑取单菌落于液体培养基上，过夜摇床后提取质粒。质粒的提取：利用碱裂解法提取质粒DNA。

目的DNA片段的PCR扩增及反应条件优化

采用50μl的PCR反应体系，包括：ddH₂O 39μl、10×PCR Buffer 5μl、10mM的dNTPs 1μl、10μM的引物all-F 1μl、10μM的下游引物-R 1μl、DNA模板1μl、2U/μl的Taq DNA聚合酶1μl。扩增条件为：94℃预变性5min、94℃变性30s、退火温度49-54℃30s、72℃延伸1-3min、共30-35个循环、72℃再延伸10min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA目的条带。根据测定结果，进行PCR条件的优化，如改变PCR反应体系中的dNTPs的量，反应条件中的退火温度、循环转数以及延伸时间，使扩增的目的条带清晰且单一。

表2 各DNA片段的最佳PCR反应条件。

DNA Marker设计

该Marker中1000bp的DNA片段终浓度设计约为20ng/μl，其余各DNA片段终浓度设计约为10ng/μl。

DNA片段含量测定：将扩增产物中低分子量的DNA片段（100bp，250bp）用DNA快速纯化试剂盒进行纯化后用超微量核酸蛋白浓度测定仪测定核酸含量；其余各片段直接用超微量核酸蛋白浓度测定仪进行含量测定。

少量DNA Marker配方摸索及体系放大：按预制Marker体积计算各DNA片段含量及应取样体积，取相应体积500bp以上DNA片段的PCR产物混合，按量加入已纯化的100bp，250bp的DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳检测Marker效果，据电泳效果微调各片段的浓度，确定各扩增产物的配比。将反应体系放大到400μl。为增加DNA Marker的辨认效果，突出指示条带，标亮1000bp。按2.5% 的比例加入Loading Buffer 和7.5%的甘油，混匀后用琼脂糖凝胶电泳检测DNA Marker效果，根据琼脂糖凝胶图像微调各片段的浓度，得到效果满意、条带清晰、1000bp高亮的DL2000 DNA Marker。

附图说明

图1 DL2000 DNA Marker各片段PCR扩增

Lane 1~7 分别为 100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp的扩增产物。

图2 DL2000 DNA Marker的琼脂糖凝胶电泳

Lane 1~4 DL2000 DNA Marker。

具体实施方式

用实施例来说明本发明DNA Marker及其制备工艺实施内容。但本发明的内容不局限于以下实施例。

实施例：制备400μl DL2000 DNA Marker。

（1）引物的设计

在NCBI中找到SEQ No.1质粒序列（GenBank：CS054777.1）后用DNAStar-Lasergene软件进行设计引物，引物序列如表1。

（2）细菌的复苏

从超低温储存箱（-86℃）中取出大肠杆菌JM109(SEQ No.1），在无菌操作台上取50μl加至5ml的已加5μl氨苄青霉素（Amp）LB液体培养基试管中，放置于气浴摇床中以37℃、140r/min的温度和转速培养10-12h。

（3）细菌的纯化

取活化的JM109(SEQ No.1）100μl涂布于含氨苄青霉素的固体培养基上，在37℃的光照恒温培养箱中倒置培养16-18h。用已灭菌的牙签挑单菌落，放入已含氨苄青霉素的LB液体培养基中，置控温气浴摇床中以37℃、140r/min培养10-12h备用。

（4） 质粒DNA的提取：用碱裂解法提取质粒DNA, 具体步骤如下：

A．将菌液转入1.5ml的Eppendorf管中，以8000r/min转速1min将细菌沉淀至管底，除尽上层培养基；

B．加入100μl预冷的溶液I，放置漩涡振荡仪充分悬浮细菌，加入4μl RNase，室温放置2min。加入200μl的溶液II，快速颠倒，温和混匀，冰浴5min。再向其中加入150μl冰上预冷的溶液III，温和混匀，冰浴5min；

C．12000r/min转速5min，沉淀白色絮状物，将上层清液转至另一1.5mlEppendorf管中。

D．向其中加入2倍上层清液体积且预冷的无水乙醇，混匀，放置与-20℃冷藏20min；

E．取出后12000r/min转速5min，除尽上层清液。加入500μl的70%乙醇清洗沉淀，以3000r/min转速1min沉淀DNA，风干，彻底挥发除去乙醇；

F．再加入40μl 双蒸水溶解DNA，其余放置于-20℃冷藏，待用。

(5) PCR扩增及反应条件的优化

采用50μl的PCR反应体系：ddH₂O 39μl、10×PCR Buffer 5μl、10mM的dNTPs 1μl、10μM的引物all-F 1μl、10μM的引物-R 1μl、DNA模板1μl、2U/μl的Taq DNA聚合酶1μl。 PCR反应体系中的dNTPs、模板DNA、Taq DNA Polymerase用量、引物以及Mg²⁺的浓度根据实验结果的不同而进行调整优化，通过调节dNTPs、Taq DNA Polymerase的用量而其它保持初始量。而退火温度的初始拟定是根据所设计引物里的A、T、C、G的含量按照Tm=（4*G/C+2*A/T-5）来分别计算，再根据上下游引物的Tm值计算T=（Tm₁+Tm₂）/2-5，然后在计算所得温度加减2℃-3℃来设定范围，完成后梯度PCR仪根据设定范围会给出8个温度梯度。通过微调PCR条件中的dNTPs的用量以及循环数来提高目的基因浓度，实现每一条带的优化，得到一个客观的最优PCR条件，最后确定各DNA片段的最佳PCR反应条件见表二。

(6) 各DNA片段配方优化

为了突出指示效果，将1000bp的DNA片段设为高亮，在DNA Marker中的终浓度约为20 ng /μl，其余DNA片段终浓度设计为约10 ng /μl；将低分子量的DNA片段（100bp，250bp）用DNA快速纯化试剂盒纯化后用超微量核酸蛋白浓度测定仪测定核酸含量，其余DNA片段直接用超微量核酸蛋白浓度测定仪测定核酸含量。

在最佳反应条件下扩增各片段DNA后，2000 bp、1500bp、1000 bp、750 bp、500 bp的DNA片段含量经测定分别为：89.68 ng/μl、89.68 ng/μl、86.87 ng/μl、80.65 ng/μl、113.00 ng/μl。另外，250 bp、100 bp的PCR产物经浓缩纯化后，含量均为117.42 ng/μl。

据DNA片段含量计算需加入体积分别为：44.6μl、44.6μl、92.1μl、49.6μl、35.4μl、34.1μl、34.1μl。按计算结果取相应量混合，按2.5% 的比例即加入20μl Loading Buffer 和7.5%即30μl的甘油，用灭菌水定容到接近400μl，混匀后用琼脂糖凝胶电泳检测DNA Marker效果，根据琼脂糖凝胶图像微调各片段的浓度，得到效果满意、条带清晰、1000bp高亮的DL2000 DNA Marker。