一种玻璃微量吸液器的制备方法及应用
【专利摘要】本发明公开了一种玻璃微量吸液器的制备方法及应用，通过将1mm 玻璃毛细管加热变软后，两端拉开，将断裂形成尖端打磨形成直径为25~30 μm的开口，非尖端的一端与橡皮软管相连，橡皮软管的末端密封，即得玻璃微量吸液器。该玻璃微量吸液器可显微分离微量液态组织，本发明利用该吸液器分离了高纯度的甘蓝型油菜液态胚乳，同时公开了液态胚乳基因组DNA抽提方法，可为研究三倍体胚乳的发育，胚乳和胚胎间的相互作用机理提供高纯度材料和DNA。
【专利说明】
一种玻璃微量吸液器的制备方法及应用
技术领域
[0001]本发明属于显微操作和分子生物学技术领域。更具体涉及一种玻璃微量吸液器的制备方法及应用。【背景技术】
[0002]油菜是世界第三大油料作物，也是我国继水稻、小麦、玉米和大豆之后的第五大农作物。除了作为食用油的主要原料之外，油菜也是重要的工业原料和欧盟主要成员国可再生能源的主要生物资源。我国油菜的种植面积和总产量均占世界的30%左右，它不仅关系到我国种植业结构的调整、优化和近亿农民的增收，也关系到满足人民生活水平提高、膳食结构改善及保障国家食物安全的需要，因此，加强油菜生产意义重大。
[0003]油菜属于被子植物门(六]^；[〇8口61'11^6)芸薹属(1^38 8；^30636)植物。甘蓝型油菜 (Brassica napus L.)为异源二倍体(AACC)作物。它的形成是在大约7500年以前，两个祖先种白菜(AA)和甘蓝(CC)通过杂交然后多倍体化之后形成。因此甘蓝型油菜也是研究基因组多倍体进化的理想材料。
[0004]被子植物种子的发育是由双受精开始的:其中一个精细胞和卵细胞融合生成合子，之后发育成胚胎;另一个精细胞和二倍体中央细胞融合形成三倍体受精极核，最终发育成胚乳。胚乳包裹着胚胎，但被珠被所包被。种子的发育过程存在胚乳发育和胚胎发育的相互协同作用。胚乳发育的异常往往导致胚胎发育的停滞，暗示其在种子发育过程中的重要性。有研究表明，模式植物拟南芥和甘蓝型油菜种子的含油量受到母体效应的影响。而母体效应可以分为三种不同的类型:细胞质遗传，胚乳核以及母本表型。芸薹属植物的胚乳被认为参与了营养物质通过维管组织从母本植株到胚胎的运输。实验研究同样表明胚乳也可以控制种子大小。此外，胚乳中一些和脂质和糖代谢相关基因的表达也很活跃。在胚乳中存在的不同代谢产物的转运蛋白参与了胚胎发育过程中油脂积累过程。同样地，储藏脂质的代谢和分解也受胚乳的部分调控。除了给胚胎提供营养，母体组织胚乳同样被认为是表观调控的场所。胚乳中优势表达的一些基因(包括绝大部分储藏蛋白和淀粉合成酶基因)在水稻胚乳中往往出现去甲基化。因此，研究胚乳发育的机理以及胚乳和胚胎的互作在含油量等重要农艺性状上的作用显得尤为重要。但是分离高纯度的液态胚乳并非易事，因为胚乳被很小的而且为圆形的珠被所包裹，并且和发育中的胚胎紧密相邻。[〇〇〇5]目前还没有合适的方法来保证分离高纯度液态胚乳并进行高浓度、高质量DNA的提取，本申请通过建立快速高效地分离高纯度液态胚乳的技术以及改良的液态胚乳基因组 DNA抽提技术，为后续胚乳的发育以及胚乳和胚胎间的互作调控机理的研究奠定了基础。
【发明内容】
[0006]本发明目的是在于提供了一种玻璃微量吸液器的制备方法，材料易得，方法简单， 制备的玻璃微量吸液器在显微分离微量液态组织中具有较为广泛的应用。
[0007]本发明的另一个目的在于提供了一种玻璃微量吸液器的应用，该吸液器可用于显微分离微量液态组织。
[0008]本发明目的是在于提供了一种高效的高纯度油菜液态胚乳分离方法，该方法为后续开展胚乳方面的研究提供了基础。
[0009]本发明还有一个目的是在于提供了一种油菜胚乳基因组DNA的提取方法。该方法可以获取高浓度、高质量的基因组DNA，满足后续分子生物学实验的需求。
[0010]为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施:
[0011]—种玻璃微量吸液器的制备方法，包括:
[0012]1mm玻璃毛细管加热变软后，将毛细管缓慢地从两端拉开，毛细管最后断裂形成非常细的尖端，将尖端打磨形成直径为25?30wii的开口，非尖端的一端与橡皮软管相连，橡皮软管的末端密封，即得玻璃微量吸液器。[〇〇13]优选的，橡皮软管的末端通过由毛细管烧制的玻璃塞密封。
[0014]一种玻璃微量吸液器在显微分离微量液态组织中的应用，包括现有技术中需要吸取微量液态组织的操作均可利用本发明提供的玻璃微量吸液器。
[0015]—种高效的高纯度油菜液态胚乳分离方法，包括:
[0016]选择甘蓝型油菜开花后胚珠体积定型时的胚珠作为分离胚乳的材料，在胚珠远离胚胎且靠近合点端的位置利用钢针打孔，刺破胚囊后，将玻璃微量吸液器迅速插入打孔处， 缓缓吸取胚乳，然后转移至放置在冰上的EP管内；吸取的胚乳镜检观察胚乳纯度。
[0017]以上所述的方法，整个过程在冰上进行，时间控制在20s内。[〇〇18]所述的材料为甘蓝型油菜开花后第25-30天的胚珠。
[0019]以上所述的方案中，打孔时，切勿打穿，刺破胚囊即可;打孔切勿打在胚胎上。
[0020]—种油菜胚乳基因组DNA的提取方法，包括:
[0021]用CTAB-free缓冲液(200mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)，50mmol/L EDTA，250mmol/L NaCl，1 %0-mercaptoethanol)将分离的液态胚乳进行洗涤;然后，用CTAB抽提液重新悬浮洗涤后的胚乳细胞，再在EP管中放置3?5个5mm钢珠，迅速将EP管放入液氮冷冻。再将其放置在室温中解冻。待解冻至形成冰水混合物的时候，将EP管放置在组织研磨仪震荡25?30 秒，随后采用传统的CTAB方法来抽提基因组DNA。
[0022]与现有技术相比，本发明的优点在于:
[0023]由于甘蓝型油菜液态胚乳包被于小的而且圆形的珠被里面，且其本身也和发育的胚胎紧密相邻，因此分离出高纯度液态胚乳存在困难。传统采用挤压的方式获得液态胚乳， 但此方法容易造成其他组织的污染，且这种污染很难去除。本发明首次从甘蓝型油菜ZY036 开花后25天胚珠中分离得到了高纯度液态胚乳。本发明首次通过改良的液态胚乳基因组 DNA提取方法获得了高质量、高浓度的基因组DNA。总之，该发明为后期研究的开展奠定了较好基础。
[0024]种子作为人类重要的食物来源，具有举足轻重的作用。三倍体胚乳和胚胎间存在着密不可分的相互作用。虽然大多数双子叶植物胚乳最终降解，且其营养被膨大的子叶所吸收，最终只留下很薄的一层。但是胚乳的缺陷均会导致胚胎发育停滞。再者，单子叶植物的胚乳占成熟种子绝大部分。由此可见，胚乳的研究是十分有必要的。但是由于早期液态胚乳包被于小的珠被之内，且紧靠发育中的胚胎，为分离高纯度胚乳制造了难度。本发明中的高纯度液态胚乳分离技术在植物，特别是重要作物中的研究将会发挥重要作用。
[0025]在生物研究领域，有些材料小、少，或者深埋在其他组织内部。因此，需要诸如玻璃微量吸液器的器具来进行操作，从而获得高纯度的足量的实验材料，为后续实验的开展奠定基础。本发明提供玻璃微量吸液器可手工制备，方法简便，可行。且操作该玻璃微量吸液器收集材料简单、方便。为开展类似微量材料的收集提供了便利。【附图说明】
[0026]图1玻璃微量吸液器的制备过程示意图。
[0027]图2不同发育时期角果的形态及不同发育时期胚珠的形态示意图。
[0028]其中图2中A为不同发育时期角果的形态;图2中B为不同发育时期胚珠的形态。 [〇〇29]图3为开花后第25天的胚珠示意图；[〇〇3〇]其中图3中A为开花后25天胚胎的形态；图3中B为开花后25天胚胎在开花后25天胚珠中的相对位置及所占空间大小，黑色虚线之上的靠近合点端的部分为安全打孔区域；；图 3中C为开花后25天胚珠纵切结构示意图。[〇〇31]图4分离液态胚乳及其DNA抽提的流程。
[0032]图5分离的胚乳的形态及纯度检测示意图。[〇〇33]图6电泳检测不同方法抽提的油菜液态胚乳基因组DNA示意图。[〇〇34]其中图6中A为利用商业化试剂盒抽提的油菜液态胚乳基因组DNA [〇〇35]图6中B为本发明提供的方法抽提的油菜液态胚乳基因组DNA。【具体实施方式】[〇〇36]本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。所述试剂或材料， 如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明实施例以甘蓝型油菜ZY036为例，进行说明。 [〇〇37] 实施例1.
[0038]—种玻璃微量吸液器的制备方法，包括:
[0039]1_玻璃毛细管在酒精灯火焰上加热，待毛细管受热区域变软，缓慢从毛细管两端拉开，毛细管最后断裂形成非常细的尖端，对形成的尖端打磨形成直径为25?30m的开口， 将非尖端的一端与橡皮软管相连，橡皮软管的末端用玻璃塞子封住，即得玻璃微量吸液器 (图 1)。
[0040]所述的玻璃塞子为毛细管烧制。[〇〇41 ] 实施例2:
[0042]确定用于分离液态胚乳的胚珠的发育时期[〇〇43]本实施例中使用细线对正开花的甘蓝型油菜ZY036的花进行标记。随后，分别取开花后8天、16天、22天、24天、25天、26天和28天的角果进行观察，发现角果长度大约在开花后 25天定型(图2中A)。此外，在解剖镜下分离不同时间段的胚珠，然后在体式显微镜下观察， 发现胚珠体积在开花后8天到22天变化最快，在第25天时胚珠体积基本定型(图2中B)。因此，最终选择开花后25天的胚珠作为分离胚乳的材料，用于以下实施例。
[0044]实施例3:
[0045]选择甘蓝型油菜ZY036胚珠表面最佳的打孔位置[〇〇46] 利用剥针在倒置显微镜(OLYMPUS 1X71)下分离ZY036 25DAF胚珠中的胚胎，并观察其形态，明确25DAF ZY036的胚胎为鱼雷型胚胎时期(torpedo stage)(图3中A);根据 ZY03625DAF胚珠和胚胎的大小和形态结构特征，利用Photoshop模拟25DAF胚胎在整个胚珠中的位置及所占空间(图3中B和图3中C)，明确在胚珠表面上远离胚胎且靠近合点端部位为打孔的最佳合理位置(图3中B所示的黑色虚线以上，靠近合点端为打孔安全区域)。[〇〇47] 实施例4:
[0048] —种高效的高纯度油菜液态胚乳分离方法，包括:
[0049]在解剖镜下利用钢针在甘蓝型油菜胚珠表面上远离胚胎且靠近合点端部位表面打孔(打孔时，切勿打穿，刺破胚囊即可)，刺破胚囊后(打的孔确保在图2B所示的安全区域， 切勿打在胚胎上，否则会造成其他组织的污染)，将实施例1制备的玻璃微量吸液器迅速插入打孔处(插入前挤压橡皮软管，释放里面的气体)，缓缓吸取胚乳，然后转移至放置在冰上的EP管内。
[0050]以上整个过程在冰上进行，时间控制在20s内，吸取的胚乳镜检观察无其他细胞污染(图5)。[〇〇51 ] 整个操作过程请见图4。[〇〇52] 实施例5:[〇〇53] 一种油菜胚乳基因组DNA的提取方法，包括:
[0054]用 1.5ml CTAB-free缓冲液(200mmol/L Tris-HCl(pH = 8.0)，50mmol/L EDTA， 250mmol/L NaCl，1%0-mercaptoethanol)将实施例4分离的液态胚乳进行洗涤:即利用lml 印pendorf移液器(蓝色枪头提前用剪刀进行扩口，防止样本在吸打过程中堵塞或弄破胚乳细胞)轻轻吸打混勾，然后在4°C提前预冷的冷冻离心机里面以llOOrpm离心4min，弃上清； 然后，用750yl CTAB抽提液重新悬浮洗涤后的胚乳细胞，再在EP管中放置5个5mm钢珠，迅速将EP管放入液氮冷冻。再将其放置在室温中解冻。待解冻至形成冰水混合物的时候，将EP管放置于SK450型震动式混合机(上海苏凯化工有限公司)内震荡30秒，随后采用传统的CTAB 方法来抽提基因组DNA，最终获得200yl，浓度高达2.83ygAU，其完整性较好的基因组DNA (图 6B)〇
[0055]用商业化试剂盒(AxyPrep? Multisource Genomic DNA Miniprep Kit)对实施例 4制备的液态胚乳提取DNA。所获得的DNA完整度较好，但是浓度低(<30ng/yl)(图6A)。
【主权项】
1.一种玻璃微量吸液器的制备方法，包括:1mm玻璃毛细管加热变软后，将毛细管缓慢地从两端拉开，毛细管最后断裂形成非常 细的尖纟而，将尖纟而打磨形成直径为25?30 ym的开口，非尖纟而的一纟而与橡皮软官相连，橡皮软 管的末端密封，即得玻璃微量吸液器。2.权利要求1所述的方法制得的玻璃微量吸液器在显微分离微量液态组织中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:选择甘蓝型油菜开花后胚珠体积定型时的胚珠作为分离胚乳的材料，在胚珠远离胚胎 且靠近合点端的位置利用钢针打孔，刺破胚囊后，将玻璃微量吸液器迅速插入打孔处，缓 缓吸取胚乳，然后转移至放置在冰上的EP管内；吸取的胚乳镜检观察液态胚乳纯度；以上整个过程在冰上进行，时间控制在20s内；打孔时，切勿打穿，刺破胚囊即可；打孔 切勿打在胚胎上。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:用CTAB-free缓冲液(200 mmol/L Tris-HCl (pH=8.0), 50 mmol/L EDTA, 250 mmol/ L NaCl, 1%卢-mercaptoethanol)将分离的液态胚乳进行洗涤;然后，用CTAB抽提液重新 悬浮洗涤后的胚乳细胞，再在EP管中放置3~5个5 mm钢珠，迅速将EP管放入液氮冷冻，再将 其放置在室温中解冻;待解冻至形成冰水混合物的时候，将EP管放置在组织研磨仪震荡25? 30秒，随后采用传统的CTAB方法来抽提基因组DNA。
【文档编号】C03B23/047GK106000496SQ201610397570
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】华玮, 李俊, 范世航, 孙兴超, 胡志勇, 刘静, 朱晓义, 郑明 , 孙凤明
【申请人】中国农业科学院油料作物研究所