一种同时降低白酒酒醅中氨基甲酸乙酯和其前体的方法与流程

本发明涉及一种同时降低白酒酒醅中氨基甲酸乙酯和其前体的方法，属于发酵食品生产技术领域。

背景技术：

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，简称EC)，是一类2A类致癌性化学污染物，在发酵食品和饮料酒中普遍存在。EC的持续过量摄入可能会引起严重的肿瘤疾病，并会危害人体的免疫系统。

据报道，饮料酒(尤其是蒸馏酒)是人体摄入EC的主要途径。白酒产业是我国传统的蒸馏酒，也是我国所特有的传统酒种，在漫长的发展过程中，形成了独特的工艺和风格，在世界蒸馏酒中独树一帜，以其特有的色、香、味、格受到了广大饮用者的喜爱。目前的研究证明，在白酒的生产过程中始终潜在着一定量的致癌物质氨基甲酸乙酯(EC)，这严重影响了白酒的食品安全性。

白酒中EC的产生途径主要有两种，一是尿素途径，即尿素在酸性条件下与乙醇反应生成，或者尿素热分解后生成的异氰酸和氰酸盐与乙醇反应形成；二是氰化物途径，即氰化物被氧化为氰酸盐后与乙醇反应产生。而EC形成机制的研究说明，白酒中大部分EC是来源于酒中的尿素和乙醇的化学反应，因此对于白酒中EC的控制可分为两个方面，一种是直接降解已经形成的EC，另一种是添加功能菌株，将EC的前体物质尿素分解为CO₂、H₂O和NH₃，从而减少EC的形成。而如果可以同时减少EC及其前体物质尿素无疑可以更大程度上降低白酒生产中EC的含量。因此建立一种能同时降低白酒发酵过程中降解EC及前体能力的方法有重要的应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种同时降低白酒酒醅中氨基甲酸乙酯和其前体的方法，所述方法是将解淀粉芽孢杆菌以1～9×10⁷CFU/g的浓度接种至酒醅中。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是在酒醅入窖前进行接种。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是以菌液进行接种，接种的菌液的体积控制在5～10mL/100g酒醅。

在本发明的一种实施方式中，所述解淀粉芽孢杆菌是解淀粉芽孢杆菌JP21，，已于2016年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2016499，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

在本发明的一种实施方式中，所述接种是将所述解淀粉芽孢杆菌接种至LB液体培养基，37℃静置培养24～48h，收集菌体进行接种。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：(1)将所述解淀粉芽孢杆菌接种至LB液体培养基，37℃静置培养24～48h，收集菌体；(2)将解淀粉芽孢杆菌用无菌生理盐水重悬，以1～9×10⁷CFU/g的接种量接种至入窖酒醅中，接种体积控制在5～10mL/100g酒醅；(3)将酒醅在28-30℃发酵。

在本发明的一种实施方式中，具体方法是：(1)菌株加入酒醅：入窖混合酒醅以1～9×10⁷CFU/g的菌体接种浓度加入经无菌生理盐水重悬的解淀粉芽孢杆菌JP21，接种体积控制在5～10mL/100g酒醅；(2)发酵：酒醅发酵温度控制在28-30℃。

有益效果：本发明将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JP21接种至白酒酒醅中，可以同时降低酒醅中EC及前体尿素含量，发酵5d内即令氨基甲酸乙酯含量降低30.16％，尿素含量降低50.05％，有助于在白酒发酵前期控制酒醅中EC及前体尿素含量，且不对酒的风味有明显影响。

附图说明

图1为在1～9×10⁶CFU/g的接种量下解淀粉芽孢杆菌JP21和解淀粉芽孢杆菌JY06对酒醅中EC及尿素降解效果；

图2为在1～9×10⁷CFU/g的接种量下解淀粉芽孢杆菌JP21和解淀粉芽孢杆菌JY06对酒醅中EC及尿素降解效果。

生物材料保藏

一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JP21，已于2016年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2016499，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

具体实施方式

酒醅中尿素检测：取10g酒醅样品，加入20mL无菌水，冰浴下超声30min，离心5min(8000rpm，4℃)后取上清。检测方法参见《高效液相色谱-荧光检测器法测定黄酒中尿素含量》(邢江涛等，2011.03公开)。

酒醅中氨基甲酸乙酯检测：取10g酒醅样品，加入20mL无菌水，静置下浸泡30min，超声30min，离心5min(8000rpm，4℃)后取上清，氨基甲酸乙酯测定方法同《GB5009.223-2014食品安全国家标准食品中氨基甲酸乙酯的测定》。

实施例1：解淀粉芽孢杆菌JP21菌液体积对酒醅环境影响

挑取平板上活化好的解淀粉芽孢杆菌JP21单菌落接种于LB液体培养基中，37℃静置培养24小时，菌液离心5min(8000rpm，4℃)弃上清，所获菌体加入等体积无菌生理盐水重悬浮，调整重悬液菌体浓度。以酒醅终浓度为1～9×10⁷CFU/g的添加量向入窖酒醅中加入菌悬液，每100g酒醅中菌悬液的添加体积分别为5，10，20，30mL。接种后将重悬液和酒醅搅拌均匀，在28-30℃条件下厌氧发酵5d后观察酒醅状态。结果发现，在菌液体积20mL和30mL的情况下厌氧发酵5d，酒醅形态发生较大改变，从固态变为半固态，与白酒酒醅固态发酵情况有很大差别。其次，加入菌液体积20mL和30mL的酒醅样品呈恶臭，酸败的气味特征，证明在该菌液体积下酒醅微生物体系改变，酒醅特有风味变化，酒醅变质。而在菌液体积5mL，10mL时酒醅形态正常，气味与正常酒醅一致，因此选择酒醅加入菌液体积为酒醅体积的5％-10％。

实施例2：

以解淀粉芽孢杆菌JY06作为对照，解淀粉芽孢杆菌JY06是本实验室从酱醪中筛选所得，其培养条件与解淀粉芽孢杆菌JP21一致。

菌株培养方法同实施例1，培养菌液离心5min(8000rpm，4℃)弃上清，所获菌体加入等体积无菌生理盐水重悬浮，调整重悬液菌体浓度。以酒醅终浓度为1～9×10⁶CFU/g的添加量向入窖酒醅中加入菌悬液，每100g酒醅中菌悬液的添加量为5-10mL。接种后将重悬液和酒醅搅拌均匀，在28-30℃条件下厌氧发酵5d后测定酒醅中尿素和EC的含量。

采用相同方法培养解淀粉芽孢杆菌JY06(保藏编号为CCTCC NO:M 2015423)，并以上述相同步骤将解淀粉芽孢杆菌JY06接种至酒醅中，在相同条件下培养，测定尿素和EC含量，结果如图1所示。

发酵起始时EC含量为15.17ppb，分别加入解淀粉芽孢杆菌JY06和JP21菌液进行厌氧发酵5天后，不添加菌株的酒醅中EC含量为14.69ppb；添加菌浓为1～9×10⁶CFU/g的解淀粉芽孢杆菌JP21和解淀粉芽孢杆菌JY06的酒醅中EC含量分别为10.97ppb和14.72ppb，说明解淀粉芽孢杆菌JP21在接种量1～9×10⁶CFU/g条件下有明显的降解效果，而JY06没有降解效果。

发酵起始时尿素含量为19.53mg/kg，分别加入解淀粉芽孢杆菌JY06和JP21菌液进行厌氧发酵5天后，不添加菌株的酒醅中尿素含量为18.64mg/kg，添加菌浓为1～9×10⁶CFU/g解淀粉芽孢杆菌JP21和解淀粉芽孢杆菌JY06的酒醅中尿素含量分别为17.56mg/kg和19.07mg/kg，说明在1～9×10⁶CFU/g菌浓下JP21和JY06对尿素均没有明显降解效果。

实施例3：

菌株培养方法同实施例1。将培养后的菌液离心，收集菌体，并用无菌生理盐水重悬，向酒醅中接种解淀粉芽孢杆菌JP21，接种体积控制在5～10mL/100g酒醅，并使解淀粉芽孢杆菌JP21终浓度为1～9×10⁷CFU/g。将接种后的酒醅搅拌均匀，在28-30℃条件下进行厌氧发酵，每样品均做三个平行。按照上述相同方法将解淀粉芽孢杆菌JY06接种至入窖酒醅中，并在相同条件下厌氧发酵，发酵5d时测定酒醅中尿素和EC的含量，结果如图2所示。

发酵起始时EC含量为15.17ppb，分别加入1～9×10⁷CFU/g解淀粉芽孢杆菌JY06和JP21菌液进行厌氧发酵5天后，不添加菌株的酒醅中EC含量为14.69ppb；添加菌浓为1～9×10⁷CFU/g的解淀粉芽孢杆菌JP21和JY06的酒醅中EC含量分别为10.23ppb和14.23ppb，说明在接种量1～9×10⁷CFU/g条件下解淀粉芽孢杆菌JP21有明显的降解EC效果，而JY06没有降解效果。

发酵起始时尿素含量为19.53mg/kg，分别加入1×10⁷CFU/g解淀粉芽孢杆菌JY06和JP21菌液厌氧发酵5天后，不添加菌株的酒醅中尿素含量为18.64mg/kg，添加菌浓为1～9×10⁷CFU/g解淀粉芽孢杆菌JP21和JY06的酒醅中尿素含量分别为9.32mg/kg和19.74mg/kg，说明在1～9×10⁷CFU/g菌浓下解淀粉芽孢杆菌JP21有明显降解尿素效果，而1～9×10⁷CFU/g菌浓下解淀粉芽孢杆JY06对尿素没有降解效果。

将菌液以相同比例(每100g酒醅添加5～10mL菌液)接种至1L酒醅中，控制菌体在酒醅中终浓度为1～9×10⁷CFU/g，发酵后的酒醅中EC和尿素均能达到相似的降低效果，且未见对酒醅风味物质的破坏。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。