不吸水链霉菌W-273聚酮产物的鉴定及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，尤其属于微生物次级代谢产物领域，具体涉及一种不吸水链霉菌W-273聚酮产物的鉴定及其应用。
背景技术：
：链霉菌是一类来源于土壤的革兰氏阳性细菌，它可以产生大量的活性次生代谢产物,这些活性产物从功能上划分为抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、抗结核、免疫抑制等；从结构上划分为核苷类、多肽类、糖肽类、β-内酰胺类及聚酮类化合物等等,其中研究较多的聚酮类化合物主要包括大环内酯类、安莎类、聚醚类、蒽环类、角蒽环类及四环素类等。聚酮类化合物生物合成基因簇，是以羧酸缩合反应形式进行的。如红霉素(Streptomyceserytheara)和制霉菌素(Streptomycesnoursei)等。制霉菌素最早发现是由链霉菌Streptomycesnoursei所产生的一种抗真菌药，属于一种多烯类大环内酯，具有广谱性，对细菌无抑制作用。目前，在医学上主要用于内服治疗消化道真菌感染或外用于表面皮肤真菌感染，对农业昆虫的研究发现，高浓度制霉菌素处理能显著抑制褐飞虱体内类酵母共生菌数量,进而影响类酵母共生菌的营养合成功能。目前，关于其他链霉菌菌株可以产生制霉菌素及其在农业病害防治上的应用鲜有报道。因此，开发一种新的制霉菌素产生菌并将其应用在农业病害防治上，具有一定的创造性及新颖性，且进一步丰富了生物防治产品的种类。技术实现要素：本发明一个目的是提供不吸水链霉菌(Streptomycesahygroscopicus)W-273CGMCCNO.9604或其发酵产物或其发酵产物的提取物的用途。本发明提供了不吸水链霉菌(Streptomycesahygroscopicus)W-273CGMCCNO.9604或其发酵产物或其发酵产物的提取物在制备制霉菌素中的应用；或，不吸水链霉菌(Streptomycesahygroscopicus)W-273CGMCCNO.9604或其发酵产物或其发酵产物的提取物在制备具有抑菌功能产品中的应用。上述制霉素为制霉素A1。本发明另一个目的是提供一种具有抑菌功能产品，其活性成分为不吸水链霉菌(Streptomycesahygroscopicus)W-273CGMCCNO.9604或其发酵产物或其发酵产物的提取物。上述中，所述抑菌为抑制红酵母菌；或所述提取物为甲醇提取物。本发明另一个目的是提供一种制备制霉菌素的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：1)发酵不吸水链霉菌(Streptomycesahygroscopicus)W-273CGMCCNO.9604，收集发酵产物；2)用有机溶剂萃取所述发酵产物，得到甲醇提取物，即得到制霉菌素。上述方法中，所述有机溶剂为甲醇、正丁醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯或氯仿；或，在步骤2)中得到甲醇提取液后，还包括如下步骤：用液相色谱纯化所述甲醇提取液，收集保留时间与制霉菌素标准品一致的产物，得到制霉菌素；所述液相色谱纯化的条件为：流动相为乙腈和水等体积混合溶液；进样速度：0.5mL·min-1或1.0mL·min-1。进样量：10μL；柱温：25℃；检测波长：305nm。上述方法中，所述用甲醇萃取所述发酵产物包括如下步骤：1)收集所述发酵产物中的沉淀；2)向所述沉淀中加入所述甲醇混匀，反应，收集反应产物中的上清液，得到甲醇提取物。上述方法中，所述甲醇的加入量为按所述发酵产物与所述甲醇体积比为1：1的量加入；或所述反应的时间为30min-60min。上述方法中，所述发酵采用的培养基，每L由质量百分含量3.0％大豆粉、质量百分含量0.8％玉米粉、质量百分含量1.0％-4.0％燕麦片、质量百分含量0.01％-0.2％NaCl、质量百分含量0.01％-0.2％MgSO4、质量百分含量0.01％-0.2％％K2HPO4、质量百分含量0.01％-0.3％FeSO4、质量百分含量0.01％-1.0％CaCO3、质量百分含量0.01％-0.5％(NH4)2SO4和水组成；或，所述发酵采用的培养基，每L由质量百分含量3.0％大豆粉、质量百分含量0.8％玉米粉、质量百分含量2.0％燕麦片、质量百分含量0.02％NaCl、质量百分含量0.02％MgSO4、质量百分含量0.02％K2HPO4、质量百分含量0.02％FeSO4、质量百分含量0.5％CaCO3、质量百分含量0.25％(NH4)2SO4和水组成；或，所述发酵的条件为28℃、200r·min-1、96h。上述制霉素为制霉素A1。本发明另一个目的是提供一种制备不吸水链霉菌(Streptomycesahygroscopicus)W-273CGMCCNO.9604发酵产物的甲醇提取物的方法。本发明提供的方法，包括上述的步骤1)-2)：得到甲醇提取物。上述的方法制备的甲醇提取物也是本发明保护的范围；或所述甲醇提取物在制备具有抑菌功能产品中的应用也是本发明保护的范围。不吸水链霉菌W-273(Streptomycesahygroscopicus)于2014年8月26日，保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCCNo.9604，分类命名：不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)。本发明的实验证明，不吸水链霉菌W-273能够产生一种聚酮产物，且这种聚酮产物具有制霉菌素成分A1的结构，对真菌具有良好的抑制作用，在农业生产上能够具有开发成生物防治产品的潜能。附图说明图1为武夷菌素生物合成基因簇。图2为聚酮化合物骨架的合成。图3为制霉菌素成分A1的化学结构图。图4为聚酮产物的抑菌活性测定。图5为W-273发酵N,N-二甲基甲酰胺萃取液的液相色谱图。图6为制霉菌素纯品抑菌活性测定。图7为甲醇萃取液的抑菌活性测定。图8为W-273发酵甲醇萃取液的液相色谱图。图9为优化液相条件后W-273发酵甲醇萃取液的液相色谱图。图10为优化液相条件后W-273发酵甲醇萃取液的液相色谱图。图11为W-273发酵甲醇萃取液的质谱图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、不吸水链霉菌W-273生产聚酮产物的预测一、不吸水链霉菌W-273的聚酮生物合成基因簇的挖掘不吸水链霉菌W-273(Streptomycesahygroscopicus)于2014年8月26日，保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCCNo.9604，分类命名：不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)。采用不吸水链霉菌W-273(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensisstrainW-273)(保藏号：CGMCCNO.9604)作为通过全基因组扫描及测序缺口的填补，最终获得了12834bp与武夷菌素生物合成相关的连续聚酮基因簇序列，并利用专利一种链霉菌中聚酮生物合成基因簇及其扩增引物与试剂盒所公开的引物对，进行扩增，最后获得完整的基因簇序列。使用RAST软件对所获得的聚酮生物合成基因簇序列进行开放阅读框的分析。生物信息学分析表明，该生物合成基因簇(图1)共包含22个开放阅读框，其中wysI、wysJ、wysK、wysA、wysB、wysC6个基因负责聚酮长链骨架的合成；wysR、wysRII、wysRIII、wysPI、wysPII、wysPIII6个基因编码转录调控子；wysG、wysH2个基因编码ABC转运蛋白；wysDI、wysDII、wysDIII共3个基因负责糖基的合成与附着；wysL、wysM、wysN、wysE、wysF共5个基因编码其他后修饰蛋白与未知功能的蛋白。表1为武夷菌素生物合成基因簇的功能分析wysF基因位于基因簇核苷序列第228-1碱基处，长度为228bp，编码75个氨基酸，编码热激蛋白。wysG基因位于基因簇核苷序列第2216-396碱基处，长度分别为18211bp，编码606个氨基酸，编码产物属于ATP依赖性的ABC转运蛋白家族。wysH基因位于基因簇核苷序列第3948-2194碱基处，基因长度1755bp，编码584个氨基酸，编码产物属于ATP依赖性的ABC转运蛋白家族。wysDIII基因位于基因簇核苷序列第3964-4083碱基处，长度为1089bp，编码362个氨基酸，编码产物与GDP-甘露糖-4,6-脱水酶极其相似，推测可能负责氨基海藻糖合成的起始阶段。wysI基因位于基因簇核苷序列第4196-32707碱基处，长度为28512bp，编码9503个氨基酸，包含6个完整的模块，wysI可能负责武夷菌素聚酮骨架形成中第9-14步延伸。wysJ基因位于基因簇核苷序列第32866-49158碱基处，长度为16293bp，编码5430个氨基酸，包含3个完整的模块，wysJ可能负责武夷菌素聚酮骨架形成中第15-17步延伸。wysK基因位于基因簇核苷序列第50124-56294碱基处，长度为6171bp，编码2056个氨基酸，包含1个完整的模块，wysK可能负责武夷菌素聚酮骨架形成中第18步延伸。wysL基因位于基因簇核苷序列第56653-57837碱基处，长度为1185bp，编码394个氨基酸，编码蛋白属于细胞色素P450单氧酶，存在一个CypXsuperfamily，推测可能负责聚酮化合物部分的羟基化和负责武夷菌素生物合成中的后修饰。wysM基因位于基因簇核苷序列第58113-57922碱基处，长度为192bp，编码63个氨基酸，编码铁氧还蛋白。wysN基因位于基因簇核苷序列第59314-58163碱基处，长度为1152bp，编码383个氨基酸，编码蛋白属于细胞色素P450单氧酶。wysDII基因位于基因簇核苷序列第60414-59356碱基处，长度为1059bp，编码352个氨基酸，编码氨基转移酶，wysDII蛋白含有AAT-Isuperfamily，是一种依赖于吡哆磷酸醛(PLP)的酶。wysDI基因位于基因簇核苷序列第61824-60433碱基处，长度为1392bp，编码463个氨基酸，编码糖基转移酶，蛋白结构域中含有GTB拓扑结构，能够使催化反应的亚结构域保持稳定。wysA基因位于基因簇核苷序列第66181-66311碱基处，长度为4131bp，编码1376个氨基酸，含有KS、DH、AT和ACP结构域。wysB基因位于基因簇核苷序列第66357-75935碱基处，长度为9579bp，编码3192个氨基酸。编码模块1和模块2。wysC基因位于基因簇核苷序列第75955-109194碱基处，长度为33240bp，编码11079个氨基酸，包含6个完整的模块，是细菌中最大的聚酮合酶。wysE基因位于基因簇核苷序列第109498-10247碱基处，长度为750bp，编码249个氨基酸，编码的蛋白中都存在着一个硫酯酶结构域，主要作用是将聚酮长链从PKS上水解下来。wysPI基因位于基因簇核苷序列第110700-113555碱基处，长度为2856bp，编码951个氨基酸，编码的产物属于luxR家族蛋白含有PAS-like结构域。wysPII基因位于基因簇核苷序列第113657-116437碱基处，长度为2781bp，编码926个氨基酸，编码的产物属于luxR家族蛋白含有PAS-like结构域。wysPIII基因核苷序列第116427-119210第碱基处，位于基因簇长度为2784bp，编码927个氨基酸，编码的产物属于luxR家族蛋白含有PAS-like结构域。wysR基因位于基因簇核苷序列第119737-120318碱基处，长度为582bp，编码193个氨基酸，编码的产物属于luxR家族蛋白含有PAS-like结构域。wysRII基因位于基因簇核苷序列第121018-121779碱基处，长度为762bp，编码253个氨基酸，编码的蛋白WysRII属于DeoR家族。wysRIII基因位于基因簇核苷序列第122807-121784碱基处，长度为1023bp，编码340个氨基酸，编码AsnC家族转录调节蛋白。根据聚酮合酶相关基因的特征，可以推测该菌可生产聚酮化合物，且可推测出该聚酮化合物的结构。以乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A为碳链延长单元，KS结构域负责催化两个二碳单元的缩合以及新的C-C键形成。KR结构域负责二碳单元中羰基的还原，含有KR结构域模块一般会形成带羟基的二碳单元。AT是酰基转移结构域，负责二碳单元的加载以及向KS结构域的转移。ACP是酰基载体蛋白，负责延长中碳链的锚定。DH结构域负责催化KR结构域生成的含羟基的二碳单元的脱水反应，产物是含双键的二碳单元。还有很少一部分结构含有ER，负责催化含双键的二碳单元的加氢反应，生成碳碳单键。多聚酮链的合成就是在这些模块的催化作用下不断加载二碳单元完成的。根据基因簇推测产物可能是聚酮化合物，骨架结构如下图2所示。该骨架结构与制霉菌素主效成分A1有一定同源性，推测该聚酮化合物可能与制霉菌素具有相似结构，如下图3所示。实施例2、不吸水链霉菌W-273生产制霉菌素(一)不吸水链霉菌W-273生产制霉菌素的初次实验1、聚酮基因簇对应物质发酵：(1)种子培养基FD-1(1L)：8.0g葡萄糖，4.5g(NH4)2SO4，2.0gKH2PO4，1.0gMg2SO4·7H2O，21.0gMops(3-N吗啡-丙磺酸)，3mlTMS-1，其余为水。TMS-1(1L)：5.0gFeSO4·7H2O，390mgCuSO4·5H2O，440mgZnSO4·7H2O，150mgMnSO4H2O，10mgNaMoO4·2H2O，20mgCoCl2·2H2O和50ml体积百分含量37％HCl水溶液，其余为水。(2)发酵培养基(1L)：25.0g葡萄糖，8.3g(NH4)2SO4，1.5gKH2PO4，1.0gMg2SO4·7H2O，21.0gMops(3-N吗啡-丙磺酸)，3mlTMS-1。将链霉菌W-273的孢子接种到种子培养基，28℃、200r·min-1、48h，得到种子液。将种子液按体积百分含量2.5％的比例接种到发酵培养基，28℃、200r·min-1、72h，得到发酵液。物质萃取：将上述发酵液用N,N-二甲基甲酰胺以体积比为1：1的比例进行萃取，室温萃取10min，5000r·min-1离心10min去除菌丝体，得到N,N-二甲基甲酰胺萃取液，储存于-20℃。2、聚酮基因簇对应物质抑菌试验：(1)制备红酵母菌液：将在PDA平板上培养5d的深红酵母(RhodotorulaRubra)，用棉棒刮下放入无菌水中用灭过菌的玻璃珠将菌块打散混匀，得到红酵母菌液。(2)将红酵母菌液按体积百分含量1％的比例接种到融化冷却至约40℃的PDA培养基中，摇匀倒平板。(3)在上述平板上放置灭菌的牛津杯，2个牛津杯，2个牛津杯中分别含200μLN,N-二甲基甲酰胺和200μL上述1得到的N,N-二甲基甲酰胺萃取液。结果如图4所示，A为上述1得到的N,N-二甲基甲酰胺萃取液；B为N,N-二甲基甲酰胺；N,N-二甲基甲酰胺本身可以抑制红酵母的生长，并且抑菌效果很好，当用N,N-二甲基甲酰胺来萃取发酵液时，试剂本身的抑菌作用会掩盖萃取出的物质的抑菌效果，因此从抑菌试验来看，N,N-二甲基甲酰胺不适合做此实验中的萃取剂。3、聚酮基因簇对应物质高效液相色谱试验：(1)标品的配制：将制霉菌素标准品(德国Dr.Ehrensorfer公司CASNo.1400-61-9，制霉菌素A1)溶于色谱级N,N-二甲基甲酰胺配制成浓度为4mg/mL的溶液，依次稀释成2mg/mL、1mg/mL，并过孔径为0.22μm滤膜处理。(2)样品的处理：将上述1得到的N,N-二甲基甲酰胺萃取液过滤膜(孔径为0.22μm)处理。(3)液相条件：流动相：[甲醇：水：二甲基甲酰胺(550+300+150即11:6:3)]，进样速度：1.0mL·min-1；进样量：10μL；柱温：25℃；检测波长：305nm。色谱柱为沃特世科技有限公司(Waters),Symmetry,C18,5.0μm，(4.6mm×250mm)产品货号：WAT05427。将上述配置好的标品和处理后的样品按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图5所示，A为标准品1mg/mL，峰面积：57323，保留时间：7.066min；B为W-273发酵N,N-二甲基甲酰胺萃取液，主要物质A峰面积：2756.4，保留时间：2.433min；主要物质B峰面积：2983.1，保留时间：3.006min。将上述萃取液通过液相色谱比对发现，在同一液相条件下萃取物质的主要成分的保留时间与标准品的保留时间不一致，并且出现两个主峰，分析原因可能有两个：一是萃取出来的物质不是目标产物；二是液相条件不合适。基于(一)中发酵培养基中菌体生长不稳定且菌丝的量生长缓慢，抑菌试验中萃取剂N,N-二甲基甲酰胺对红酵母的生长有抑制作用，液相结果萃取物质保留时间与标准品不一致等问题，重新换用新的培养基配方，萃取条件。(二)不吸水链霉菌W-273生产聚酮产物的发酵和萃取条件优化1、聚酮基因簇对应物质发酵(1)种子发酵培养基(1L)：质量百分含量2.0％葡萄糖、质量百分含量0.6％蛋白胨、质量百分含量0.6％酵母粉、质量百分含量1％NaCl，其余为水，PH7.2。(2)发酵培养基(1L)：质量百分含量3.0％大豆粉、质量百分含量0.8％玉米粉、质量百分含量2.0％燕麦片、质量百分含量0.02％NaCl、质量百分含量0.02％MgSO4、质量百分含量0.02％K2HPO4、质量百分含量0.02％FeSO4、质量百分含量0.5％CaCO3、质量百分含量0.25％(NH4)2SO4，其余为水，PH7.2。将链霉菌W-273的孢子接种到种子培养基，28℃、200r·min-1、24h，得到种子液。将种子液按体积百分含量3％的比例接种到发酵培养基，28℃、200r·min-1、96h，得到发酵液。物质萃取：将上述发酵液6000r·min-1，离心10min，收集初次沉淀；向初次沉淀中加入与发酵液等体积的无菌水进行洗涤，振荡30min，6000r·min-1离心10min，弃去上清液，收集二次沉淀；向二次沉淀中按发酵液与甲醇体积比为1：1的量加入甲醇，振荡30min-60min，6000r·min-1离心10min，收集上清液即甲醇萃取液。2、聚酮基因簇对应物质抑菌试验：(1)制备红酵母菌液：将在PDA平板上培养5d的(深红酵母RhodotorulaRubra)用棉棒刮下放入无菌水中用灭过菌的玻璃珠将菌块打散混匀，得到红酵母菌液。(2)将红酵母菌液按体积百分含量1％的比例接种到融化冷却至约40℃的PDA培养基中，摇匀倒平板。(3)在上述平板上放置灭菌的2个牛津杯，2个牛津杯中分别含200μL甲醇和200μL上述1得到的甲醇萃取液或浓度为1mg/mL制霉菌素溶液，溶剂为甲醇。制霉菌素A1标品购于德国Dr.Ehrensorfer公司CASNo.1400-61-9。制霉菌素溶液和甲醇的结果如图6所示，A为甲醇；B：制霉菌素标品甲醇溶液；甲醇萃取液溶液和甲醇的结果如图7所示，A为甲醇；B：甲醇萃取液；可以看出，当制霉菌素浓度为1mg/mL的时候，其对红酵母的抑菌圈为35mm；甲醇萃取液的抑菌圈为25.4mm，萃取液抑菌圈透明、边界清晰；表明，链霉菌W-273的发酵萃取产物可以抑制红酵母。3、聚酮基因簇对应物质高效液相色谱试验：1)高效液相色谱试验(1)标品的配制：将制霉菌素标准品(德国Dr.Ehrensorfer公司CASNo.1400-61-9，制霉菌素A1)溶于色谱级甲醇配制4mg/mL溶液，依次稀释成2mg/mL、1mg/mL，并过孔径为0.22μm滤膜处理。(2)样品的处理：将甲醇萃取液过滤膜(直径为0.22μm)处理。(3)液相条件：流动相：[甲醇：水：二甲基甲酰胺(550+300+150即11:6:3)]，进样速度：0.5mL·min-1；进样量：10μL；柱温：25℃；检测波长：305nm。将上述配置好的标品和处理后的样品按照上述条件进行高效液相色谱检测，结果如图8所示，A为标准品1mg/mL，峰面积：56548.9保留时间：10.304min；B为甲醇萃取液，主要物质峰面积：5873.5保留时间：13.893min；可以看出，在此液相试验中，发现萃取的主要物质保留时间与标准品仍不一致，但发现有一萃取物质的出峰时间(10.398min)与标准品保留时间(10.304min)很接近，但是峰面积很小，因次尝试其他液相条件。2)高效液相色谱试验条件优化(1)标品的配制：与1)相同。(2)样品的处理：与1)相同。(3)液相条件：流动相：(乙腈：水＝1:1)；进样速度：1.0mL·min-1；进样量：10μL；柱温：25℃；检测波长：305nm。将上述配置好的标品和处理后的样品按照上述条件进行高效液相色谱检测；结果如图9所示，A为标准品1mg/mL，峰面积：29810，保留时间：2.585min；B为W-273发酵萃取液，峰面积：7087.9保留时间：2.771min；可以看出，在新的液相条件下，发现萃取的主要物质的保留时间与标准品的保留时间基本一致，但是保留时间太短，在两分钟左右，有溶剂峰的可能，因此尝试降低进样速度，看标准品和萃取的主要物质保留时间是否会延长，来判断是否为溶剂峰。3)高效液相色谱试验条件二次优化(1)标品的配制：与1)相同。(2)样品的处理：与1)相同。(3)液相条件：流动相：(乙腈：水＝1:1)；进样速度：0.5mL·min-1；进样量：10μL；柱温：25℃；检测波长：305nm。将上述配置好的标品和处理后的样品按照上述条件进行高效液相色谱检测；结果如图10所示，A为标准品1mg/mL，峰面积：61161.6保留时间：5.145min；B为W-273发酵萃取液，主要物质峰面积：6148.8保留时间：5.172min；可以看出，在降低进样速度后发现，萃取的主要物质保留时间与标准品保留时间仍然一致，并且保留时间延长，说明此峰不是溶剂峰。综上所述，上述(二)中的发酵条件、萃取的方法是可行的，在液相试验中，通过尝试不同的液相条件和进样速度，认为(二)中液相条件3)可行，进样速度为0.5mL·min-1时萃取的主要物质与标准品的保留时间一致，并且主峰面积较大，杂峰较少。4)质谱检测(1)标品的配制：与1)中相同。(2)样品的处理：与1)相同。(3)质谱检测仪器：超高效液相——气相飞行质谱(XevoG2-XSQTOF质谱仪)色谱条件：色谱柱：AgilentSB-C18柱(2.1mm×100mm,2.7μm)；柱温：25℃；进样量：10μL；流动相分为A、B两部分，其中A为乙腈，B为水(含0.1％甲酸)，梯度洗脱条件如表2所示：表2时间(min)A(％)B(％)0.09556.010007.010009.0955质谱条件：离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子(ESI+)扫描；检测方式：多反应监测(MultipleReactionMonitor,MRM)；离子源温度100℃；脱溶剂温度250℃；电离电压：3kV-5kV。制霉菌素A1标品结果如图11A所示，可以看出，1mg/mL，目标物质相对分子质量为926.5192；甲醇萃取液结果如图11B所示，有相对分子质量为926.5106的物质存在，表明甲醇萃取液中含有制霉菌素A1。当前第1页1 2 3