一种新的天然产物橙盖鹅膏菌多糖AC‑1及其应用的制作方法

本发明属于真菌多糖应用技术领域，具体地说，涉及一种新的天然产物橙盖鹅膏菌多糖AC-1及其应用。

背景技术：

多糖(polysaccharides)又称多聚糖，是生物体普遍存在的一类生物大分子，不仅参与细胞骨架的构成，而且是多种内源性生物活性分子的重要组成成分。近代生物化学一直把多糖视作生物体内维持细胞结构(如纤维素和几丁质)和提供能量来源(如淀粉和糖元)的物质，没有给予足够的重视。多糖的发展较蛋白质、核酸晚得多，加上多糖本身的复杂性和多样性，对多糖结构测定、表征鉴定都提出了巨大挑战。目前，多糖的研究水平要大大落后于蛋白质和核酸的研究。

近20年来，关于多糖生物活性的研究报道主要集中在免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化和降血糖等方面，其作用是多途径、多环节、多靶点的。

橙盖鹅膏菌(学名：Amanita caesarea)，又名橙盖伞、黄罗伞及白橙盖鹅膏菌，有“凯撒磨菇”之称，是鹅膏属的食用菌，原产于欧洲南部及北非。它的菌盖呈突出的橙色，菌褶及菌茎呈黄色，具有鲜橙黄色的菌盖和菌柄，未完全张开时包裹在白色的菌托里很萌，有“鸡蛋菌”的别称。

目前，对橙盖鹅膏菌多糖AC-1的精细结构与抗氧化活性研究及其应用尚未见任何报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种新的天然产物橙盖鹅膏菌多糖AC-1及其应用。

其具体技术方案为：

一种新的天然产物橙盖鹅膏菌多糖AC-1，由两个单糖组成的杂多糖，即α-D-葡萄糖和α-D–木糖以2:1的比例组成，平均分子量约为19329D，具有(1,4)-α-D-葡萄糖及(1,3,6)-α-D-glucose的骨架，6-O上连接一个→1)-α-D–木糖的侧链，橙盖鹅膏菌多糖AC-1的结构式为：

本发明所述新的天然产物橙盖鹅膏菌多糖AC-1在抗氧化药物制备过程中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的天然产物橙盖鹅膏菌多糖AC-1对DPPH^-和ABTS⁺自由基具有抗氧化作用，浓度为1mg/ml橙盖鹅膏菌多糖AC-1对DPPH抑制率为37.09％，浓度为6mg/ml橙盖鹅膏菌多糖AC-1对DPPH抑制率可达89.74％。IC₅₀值为1.69mg/ml。浓度为1mg/ml橙盖鹅膏菌多糖AC-1对ABTS抑制率为88.51％，浓度为6mg/ml橙盖鹅膏菌多糖AC-1对ABTS抑制率可达97.63％。IC₅₀值为0.92mg/ml。

附图说明

图1橙盖鹅膏菌纯多糖重均分子量；

图2橙盖鹅膏菌的红外谱；

图3橙盖鹅膏菌多糖AC-1的1H NMR图谱；

图4橙盖鹅膏菌多糖AC-1的13C NMR图谱；

图5橙盖鹅膏菌多糖AC-1的高效液相图；

图6是橙盖鹅膏菌多糖AC-1的气质联用图，其中，图6a(1,4)-α-D-葡萄糖

图6b(1,3,6)-α-D-葡萄糖，图6c→1)-α-D–木糖的侧链；

图7橙盖鹅膏菌多糖AC-1的结构；

图8橙盖鹅膏菌多糖AC-1清除DPPH作用；

图9橙盖鹅膏菌多糖AC-1清除ABTS作用。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1橙盖鹅膏菌多糖AC-1的分离提取

1.1.经过热水浸提、醇沉后，得到橙盖鹅膏菌多糖AC-1粗提物。运用DEAE-cellulose column和Sephadex G-100column进行分离纯化，得到橙盖鹅膏菌多糖AC-1。

1.2.橙盖鹅膏菌多糖AC-1的结构鉴定

运用水解、甲基化分析、气相色谱和质谱联用技术(GC-MS)、扫描电镜技术(SEM)、红外谱技术(IR)、核磁共振技术(NMR)，对橙盖鹅膏菌纯品多糖进行结构解析。

1.2.1分子量的测定

将3mg橙盖鹅膏菌多糖AC-1样品溶解于1mlddH₂O中，超声5min，进行HPGPC分析，数据用GPC软件分析后与标准曲线对照测得分子量1.1×10⁴D(标准品T-10，20，50，80，130)。

1.2.2橙盖鹅膏菌多糖AC-1的硅烷化衍生与甲基化分析

将标准单糖和上述干燥后水解产物进行硅烷化衍生步骤如下：1.0mg的样品溶解于0.2ml的无水吡啶，然后加0.2ml的六甲基二硅氮烷和0.1mg的三甲基氯硅烷，50℃温育20min，然后10000rpm离心20min，取上层溶液用于甲基化分析。

1.2.3橙盖鹅膏菌多糖AC-1GC-MS谱分析

GC条件：色谱柱：Rtx-5sil MS(5％phenylmethylsiloxane 30mm×0.25mm×0.25μm)；

进样器温度、GC-MS界面温度、离子源温度和检测器温度分别为250、250、230和250℃，升温程序：80℃(3min)10℃/min 250℃(30min)；载气：高纯氦气。

1.2.4橙盖鹅膏菌多糖AC-1的红外谱分析

当橙盖鹅膏菌多糖AC-1样品2mg左右，KBr压片，红外分光光度计4000cm^-1-400cm^-1。

1.2.5橙盖鹅膏菌多糖AC-1的核磁共振分析

取橙盖鹅膏菌多糖AC-1样品10mg左右溶于0.5mL重水(D₂O)中，在核磁共振仪上常温测定，400MHz测¹HNMR谱，400MHz测¹³CNMR谱。

1.3结果

1.3.1橙盖鹅膏菌多糖AC-1的基本性质结果

橙盖鹅膏菌纯多糖重均分子量为19329D(见图1)。

1.3.2橙盖鹅膏菌多糖AC-1的FTIR谱分析

如图2所示，橙盖鹅膏菌多糖AC-1在红外谱中显示3437.96cm^-1的宽吸收峰指定为O-H和N-H伸缩振动峰，存在着分子内和分子间的氢键。2922.85cm^-1指定为-CH2，-CH3的伸缩振动峰。1630.46cm^-1和1400.68cm^-1指定为C＝O,C＝C振动峰。1120.19cm^-1在1200-1000cm^-1范围内指定为-COOH中的C-O-H伸缩振动和吡喃环中醚键C-O-C伸缩振动。569.28cm^-1指示橙盖鹅膏菌多糖AC-1有α型吡喃环。

1.3.3橙盖鹅膏菌多糖AC-1的NMR谱分析

异头氢信号δ5.06,δ4.99指示在橙盖鹅膏菌多糖AC-1中α型异头氢存在(见图3)，且两者均与红外谱显示相一致。在碳谱中¹³C NMR(400MHz)95–105ppm区域的共振信号峰归属于α-D-葡萄糖和α-D–木糖的碳质子信号(见图4，表1)。

表1橙盖鹅膏菌多糖AC-1的¹³C NMR图中的化学位移

1.3.4橙盖鹅膏菌多糖AC-1的高效液相分析结果

橙盖鹅膏菌多糖AC-1由α-D-葡萄糖和α-D-木糖两种糖构成，比例为2:1(图5)

1.3.5橙盖鹅膏菌多糖AC-1的GC-MS谱分析结果

从橙盖鹅膏菌中获得一个结构新颖的由两个单糖组成的杂多糖，即α-D-葡萄糖和α-D–木糖以2:1的比例组成，平均分子量约为19329D，具有(1,4)-α-D-葡萄糖(图6a)及(1,3,6)-α-D-glucose的骨架(图6b)，6-O上连接一个→1)-α-D–木糖的侧链(图6c)(表2)，综上可初步推断橙盖鹅膏菌多糖AC-1的结构(见图7)。

表2橙盖鹅膏菌多糖AC-1的甲基化GC-MS数据

实施例2.橙盖鹅膏菌多糖AC-1的抗氧化活性研究

在体外运用两种化学方法测定橙盖鹅膏菌纯多糖的抗氧化活性，包括DPPH-自由基的清除、ABTS⁺阳离子自由基清除。

2.1试剂

1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH-)；30％H₂O₂；维生素C(Vc)；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)；ABTS

2.2仪器

721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)；

2.3方法

2.3.1 DPPH自由基清除能力测定

DPPH自由基清除能力测定参照Braca方法，样品提取液配置成合适浓度(1，2，3，4，5，6mg/mL)。取1mL待测溶液，加入2.0mL 0.2mM DPPH-溶液(用无水乙醇配制)，摇匀后放置30min。乙醇调零，517nm处测定A样品的吸光值。同时测定1.0mL样品溶液与2.0mL乙醇混合液，在517nm处的吸光度作为A对照。以Vc和BHT作为阳性对照。DPPH清除能力＝(1－A样品/A对照)×100％。

2.3.2 ABTS⁺阳离子自由基清除能力测定

7mmol/LABTS水溶液和2.45mmol/L过硫酸钾避光还原12-16h，ABTS溶液用PBS(pH7.4)稀释至630nm测定值为0.50±0.05。取10μL样品90μLABTS溶液混合反应，置于暗处3min。用样品PBS溶液作为样品颜色空白参比，PBS溶液为空白对照，在酶标仪上于734nm处检测。依据下列公式计算清除率：ABTS清除率(％)＝[A空白－(A样品－A对照)]/A空白×100％

2.4结果

2.4.1.橙盖鹅膏菌多糖AC-1对DPPH-自由基清除活性

纯化的橙盖鹅膏菌多糖AC-1样品多DPPH自由基有很好的清除活性，浓度为1mg/ml橙盖鹅膏菌多糖AC-1对DPPH抑制率为37.09％，浓度为6mg/ml橙盖鹅膏菌多糖AC-1对DPPH抑制率可达89.74％。IC₅₀值为1.69mg/ml，剂量越大，效果越好。

2.4.2.橙盖鹅膏菌多糖AC-1对ABTS+阳离子自由基清除的活性使用分光光度计在734nm处的测定橙盖鹅膏菌多糖AC-1对ABTS+阳离子自由基清除的活性。结果表明，浓度为1mg/ml橙盖鹅膏菌多糖AC-1对ABTS抑制率为88.51％，浓度为6mg/ml橙盖鹅膏菌多糖AC-1对ABTS抑制率可达97.63％。IC₅₀值为0.92mg/ml，剂量越大，效果越好。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。