一种tcpC实时定量PCR检测方法及用途与流程

本发明属于生物技术领域，尤其涉及表达tcpC基因的尿路致病大肠埃希菌的检测技术。

技术背景

泌尿道感染是临床最常见的感染性疾病之一，据估计，在西欧国家每年有超过1000万的人患尿路感染，在美国，尿路感染患者每年的医疗费用大约为16亿到25亿美元。女性发病率明显高于男性，每个女性一生中平均会患有症状性泌尿系感染1～3次。男性则在50岁以后由于前列腺增生高发此病。尿路感染主要由细菌自尿道上行所致，易复发。许多病人对此类疾病相关知识欠缺，重视不够，疾病得不到规范彻底的治疗，感染反复持久发作，易引起急性肾盂肾炎、肾脓肿、泌尿系结石、肾功能损伤，甚至肾功能衰竭等。有研究表明，死于尿毒症的患者中，大约有1/3是由慢性肾盂肾炎引起的。统计资料表明导致泌尿道感染的病原菌85%以上为大肠埃希菌（Escherichia coli）。这类大肠杆菌可特异性地粘附、定植于人泌尿道粘膜上皮细胞，进而引起尿道上行性感染，被称为尿路致病性大肠埃希菌（Uropathogenic E. coli i, UPEC）。大多数尿路致病大肠埃希菌菌株能分泌一种含有Toll/interleukin-1 receptor（TIR）结构域的蛋白（TIR domain-containing proteins，TcpC），TcpC能抑制巨噬细胞的吞噬和杀菌功能，是尿路致病大肠埃希菌重要的毒力因子，在肾盂肾炎的发生中发挥重要作用。

如前所述，如何快速准确的测定尿路致病大肠埃希菌成为泌尿道感染诊断和治疗的关键。目前，临床上有一些方法已经被运用于尿路致病大肠埃希菌检测中，例如细菌的分离鉴定、全自动微生物定量分析仪（TEMPO）检测、PCR、PCR-ELISA等，这些不同的方法都有其各自的优缺点和使用范围，但目前还没有一个国际公认的快速检测尿路致病大肠埃希菌的标准方法。为此，建议一种快速、高效、精确的尿路致病大肠埃希菌检测方法成为临床亟待解决的问题。而本发明建立的检测tcpC的实时荧光定量PCR检测法，为临床快速检测表达tcpC的尿路致病大肠埃希菌打下基础。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种用于tcpC实时定量PCR检测的特异引物和TaqMan探针，本发明的第二个目的是提供采用上述的特异引物和TaqMan探针的PCR反应体系和PCR方法，本发明的第三个目的是提供一种用于tcpC实时定量PCR检测的目标产物基因。本发明的方法可以快速、高效、特异、敏感的表达tcpC的尿路致病大肠埃希菌。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种用于tcpC实时定量PCR检测的特异引物和TaqMan探针，

特异引物：上游引物F：5’-CCACTGGTAGACGAGTTA-3’，下游引物R：5’-GCCTAAATCAATATTTCTCCTTAA-3’；

TaqMan探针：5’-（FAM）TTCAAGTGTCTGTTCATCATACCAA（Eclipse）-3’。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种用于tcpC实时定量PCR检测的PCR反应体系，25μL反应体系包括：

PrimeScript 1 step Enzyme Mix反转录酶 1.0μL

2× 1 step buffer缓冲液 12.5μL

上述的上游引物F 0.5μL

上述的下游引物R 0.5μL

上述TaqMan探针 0.5μL

模板/样品 2.0μL；

上述的上游引物F、下游引物R浓度分别为250nM，

镁离子浓度5.5mM，

反应体系单价离子浓度100mM。

一种用于tcpC实时定量PCR检测的PCR方法，该方法将上述的反应体系加无菌去离子水至反应总体积25μL，小心放入7500仪器，记录好被检样品、阳性对照及阴性对照，设置反应程序，循环参数为：94.0℃预变性5min，1个循环；94.0℃变性30s，56℃退火30s， 40个循环。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种用于tcpC实时定量PCR检测的目标产物基因，该目标产物基因的核苷酸序列表如SEQ ID NO:1所示。

本发明根据GenBank提供的tcpCDNA序列设计的特异引物和TaqMan探针，在特定的实时荧光定量PCR反应体系中，绘制出大肠埃希菌DNA浓度与Ct之间的标准曲线，将检验样品进行荧光定量PCR检测，根据标准曲线测得检验样品的DNA浓度。

本发明tcpC实时定量PCR检测方法，能成功检测大肠埃希菌UPEC CFT073，其线性范围为5*10²~5*10^-2ng/μL，可以同时检测96 个样品，检测时间约1~2h，并可以对起始模板准确定量。检测结果直观，能将表达tcpC的大肠埃希菌与其它肠道细菌进行区分，有较高的灵敏度、特异性、稳定性和重复性，为临床早期快速诊断表达tcpC的尿路致病大肠埃希菌所致肾盂肾炎等尿路感染及败血症等并发症打下了基础。

附图说明

图1 是本发明的大肠埃希菌UPEC CFT073 real-time PCR标准曲线。

图2 是本发明的大肠埃希菌UPEC CFT073 real-time PCR标准曲线扩增曲线。

图3 是本发明的大肠埃希菌UPEC CFT073 real-time PCR特异性扩增曲线。

图4 是本发明的大肠埃希菌UPEC CFT073 real-time PCR灵敏度试验扩增曲线。

图5 是本发明的大肠埃希菌UPEC CFT073 real-time PCR批内可重复性试验扩增曲线。

图6 是本发明的大肠埃希菌UPEC CFT073 real-time PCR批间可重复性试验扩增曲线。

图7 是本发明的大肠埃希菌UPEC CFT073 real-time PCR回收率试验扩增曲线。

具体实施方式

以下结合附图和实施例作进一步的说明。

1.引物、探针的设计与合成

采用实时荧光定量PCR探针设计软件Beacon Designer 7.8及Primer Express 3.0设计特异引物及探针。

上游引物F：5’-CCACTGGTAGACGAGTTA-3’，长度：18bp，position 562，Tm值：61.7。

下游引物R：5’-GCCTAAATCAATATTTCTCCTTAA-3’，长度：24bp，position 660，Tm值：61.1。

荧光探针P：5’-（FAM）TTCAAGTGTCTGTTCATCATACCAA（Eclipse）-3’，长度：25bp，position 624，Tm值：66.9 。

产物Product：

CCACTGGTAGACGAGTTAAATAGACTTGGTGTAATTATTTGGTATGATGAACAGACACTTGAAGTCGGCGATAGCTTAAGGAGAAATATTGATTTAGGC，长度：99bp。

该探针为TaqMan探针，5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为Eclipse，扩增目的片段的长度为99bp。引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用前用灭菌超纯水配成浓度为100mM，-20℃保存备用。

2.实时荧光定量PCR反应体系

反应条件：

引物浓度 250nM

镁离子浓度5.5mM

反应体系单价离子浓度100mM

荧光定量PCR 25μL反应体系包括：

PrimeScript 1 step Enzyme Mix反转录酶 1.0μL

2× 1 step buffer缓冲液 12.5μL

Upstream Primer上游引物F-1 0.5μL

Downstream Primer下游引物R-1 0.5μL

Template探针P-1 0.5μL

模板/样品 2.0μL

加无菌去离子水至反应总体积25μL。小心放入7500仪器，记录好被检样品、阳性对照及阴性对照，设置反应程序。

循环参数为：94.0℃预变性5min，1个循环；94.0℃变性30s，56℃退火30s， 40个循环。荧光信号的收集及数据的采集定在56℃，根据荧光曲线和Ct值判断结果。

3.模板DNA制备

样品直接热裂解法：取菌液l00μL隔水煮沸20min，取出立即置于冰上，以12000rad/min的速度离心5min，取出所得上清液，加入500μL无水乙醇混匀，12000rad/min离心10min，弃去上清液，入烘干箱烘干，再加入100μL无菌去离子水，所得液体即为所需DNA样品。

4.标准曲线的制备

复苏UPEC CFT073菌株，37±1℃培养48h，取适量菌种置于LB液体培养基中在37±1℃摇床上培养8h。将该UPEC CFT073培养物充分混匀，提取细菌基因组DNA，并测定其浓度。将原液进行10倍梯度稀释，将浓度在5*10²~5*10^-2ng/μL 5个梯度用于标准曲线的制备，荧光定量PCR扩增时每个梯度模板重复2次，最后选择阴性对照以灭菌超纯水代替。

荧光定量PCR扩增的同时PCR仪自动绘出标准曲线，横坐标为提取DNA浓度值，纵坐标为循环阈值Ct值，斜率为-3.017，截距为14.189。从标准曲线得出DNA浓度值x与循环阈值Ct之间的线性关系曲线表达式为Ct=-3.017x + 14.189，根据该表达式测算出所测样中DNA浓度值与Ct的相关性。由标准曲线得知，所建立的荧光定量PCR的相关系数为R²=0.995，表明建立的荧光定量PCR方法误差极小，符合大肠埃希菌基因tcpC检测要求。

5.特异性试验

复苏表皮葡萄球菌（ATCC8799）、金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、痢疾杆菌（CMCC51252）、变形杆菌（ATCC6380）、空肠弯曲菌（ATCC33291）、粪链球菌（ATCC29212）、大肠埃希菌（UPEC CFT073、DH5α、BL21）、白假丝酵母菌（ATCC76615）等菌株，将菌株培养物提取基因组DNA，作为荧光定量PCR模板，检测该方法的特异性。除大肠埃希菌UPEC CFT073能特异性出现S型扩增曲线，呈现阳性；而其他细菌均无反应，表明此方法的特异性很好。

6.灵敏性试验

复苏UPEC CFT073菌株，37±1℃培养48h，取适量菌种置于LB液体培养基中在37±1℃摇床上培养8h。将该UPEC CFT073培养物充分混匀，提取细菌基因组DNA，并测定其浓度。将已知浓度的DNA样品进行10倍梯度稀释，选择浓度在5*l0⁰~5*l0^-6 ng/μL 7个梯度的模板DNA进行荧光定量PCR扩增，确定其灵敏度。在荧光定量PCR方法中，模板的起始浓度越低，Ct值越大，当Ct值大于38时，定量结果被认为是不确切的。实验结果所示，PCR法检测细菌DNA提取物时，其最低可检测到5*l0^-4 ng/μL。

表1大肠埃希菌UPEC CFT073探针荧光定量PCR灵敏性检测

7.重复性试验

批内重复性试验：复苏UPEC CFT073菌株，37±1℃培养48h，取适量菌种置于LB液体培养基中在37±1℃摇床上培养8h。将该UPEC CFT073培养物充分混匀，提取细菌基因组DNA，并测定其浓度。将已知浓度的DNA样品进行10倍梯度稀释，选择浓度在5*l0¹~5*l0^-4 ng/μL6个梯度的模板DNA进行荧光定量PCR扩增，每一个浓度的DNA重复2次，以观察Ct值之间的误差。结果显示荧光定量PCR检测这5种不同浓度DNA提取物的循环数差值(△Ct)均小于0.8，标准差在0.131~0.788之间，变异系数在0.63%~2.92%之间，说明重复性好。

表2大肠埃希菌UPEC CFT073探针荧光定量PCR批内可重复性检测结果

批间重复性试验：复苏两批UPEC CFT073菌株，分别37±1℃培养48h，取适量菌种置于LB液体培养基中在37±1℃摇床上培养8h。将该UPEC CFT073培养物充分混匀，提取细菌基因组DNA，并测定其浓度。将已知浓度的DNA样品进行10倍梯度稀释，选择浓度在5*l0¹~5*l0^-4 ng/mL6个梯度的模板DNA进行荧光定量PCR扩增，每一个浓度的DNA重复2次，观察两批UPEC CFT073菌株Ct值之间的误差。计算公式见公式7.1。结果显示第一批大肠埃希菌UPEC CFT073（蓝色扩增曲线）曲线R²为0.998，第二批大肠埃希菌UPEC CFT073（紫色扩增曲线）曲线R²为0.995，变异系数为1.7%，可见该方法的重复性好。

表3大肠埃希菌UPEC CFT073探针荧光定量PCR批间可重复检测结果

循环数差值△Ct=Ct1-Ct2

变异系数CV%=标准偏差/算术平均值

标准偏差 StD公式

（公式7.1）

8.模拟样品UPEC CFT073 DNA回收效率试验

为了评价该实时荧光定量PCR方法的灵敏度与准确性，我们采用了在尿样中添加己知浓度的DNA样品的方法来检验其准确性。取5份90μL阴性尿样于1.5mlEP管中，分别添加10μL大肠埃希菌UPEC CFT073样品，经菌液直接热裂解法提取DNA后，进行荧光定量PCR检测；同时以核酸测定仪测定该大肠埃希菌样品DNA浓度。回收率计算公式为回收率%=尿样中实际浓度/DNA直接测定浓度*100%。结果显示大肠埃希菌UPEC CFT073回收率为82.7%~105.7%之间，平均值为93.34%。

表4大肠埃希菌UPEC CFT073探针荧光定量PCR回收率试验结果

<110>浙江大学城市学院

<120>一种tcpC实时定量PCR检测方法及用途

<160>8

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

CCACTGGTAG ACGAGTTA 18

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

GCCTAAATCA ATATTTCTCC TTAA 24

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

TTCAAGTGTC TGTTCATCAT ACCAA 25

<210>4

<211>99

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

CCACTGGTAG ACGAGTTAAA TAGACTTGGT GTAATTATTT GGTATGATGA ACAGACACTT 60

GAAGTCGGCG ATAGCTTAAG GAGAAATATT GATTTAGGC 99