一种金银花提取物和中成药中掺杂山银花的鉴定方法与流程

本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及一种应用单核苷酸多态性(SNP位点)鉴定金银花提取物和中成药中掺杂山银花的方法。

背景技术：

金银花Lonicerae Japonicae Flos，又称忍冬花，为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica的干燥花蕾或带初开的花。金银花以花入药，性寒，味甘，具有清热解毒，疏散风热功效。临床用于温热初期，主治外感风热，咽喉肿痛之症。金银花含有挥发油，黄酮，三萜类和绿原酸等化学成分，其中绿原酸具有抗菌、抗病毒、利胆、保肝、降压、兴奋中枢神经系统等作用，能增加肠胃蠕动能力，并能促进胃液分泌及胆汁分泌等，绿原酸的水解产物咖啡酸亦有增加白细胞和抗氧化作用，在临床上用于治疗多种急性细菌性感染和放、化疗所致的自细胞减少症有显著效果。由于金银花中绿原酸的特殊功效，市场上常将绿原酸含量多少作为评定金银花质量好坏的标准。金银花提取物的规格以绿原酸计，从5％-95％不等。，则价格也随绿原酸含量的增高而增加。山银花Lonicerae Flos是忍冬科植物灰毡毛忍冬Lonicera fulvotomentosa、红腺忍冬Lonicera confusa、华南忍冬Lonicera hypoglauca或黄褐毛忍冬Lonicera macranthoides的干燥花蕾或带初开的花。在2005年之后的《中华人民共和国药典》将金银花和山银花分开列入。由于其科属相同，性状相似，功能用量有效成分都相同，因此难以被区分。且山银花较金银花成本低，导致市场上时常有二者混杂的现象。由于缺乏标准的监管方法，市场上提取物掺假、造假越来越严重，因此，急需建立一种新的金银花提取物或中成药掺杂山银花的鉴定方法。

分子鉴定已广泛应用于中药材鉴定，而针对提取物和中成药而言，DNA降解严重，扩增长序列存在一定的困难。Shaw等的研究结果表明人参在煎煮两小时后只能扩增获得短片段。本发明开发了一对针对金银花山银花的特异性引物，可以在金银花提取物或中成药中扩增出110bp序列，在此区段开发了两个稳定的SNP位点，可以用于金银花和山银花及其混合粉末的鉴定。本专利用于鉴定金银花提取物及中成药中是否掺杂山银花。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服传统鉴别技术中存在的上述缺陷并提供一种结果准确灵敏，鉴定过程简便快速的金银花掺杂山银花的鉴定方法。本发明所利用的是在大量的金银花和山银花ITS2序列分析的基础上，开发了两个稳定的单核苷酸多态性SNPs的特点，并设计了一对特异性引物，可从金银花提取物和中成药中扩增出包含此SNP位点的区段，该区段长度约110bp。在此区段，金银花16bp和64bp碱基分别为G和C，而山银花为A和T。经过测序和峰图分析可以明显看到两处峰图的差异，若有二者混合，则可以明显看到SNP位点处有双峰出现，且可以根据双峰高度判断金银花提取物和中成药中掺杂山银花比例。

本发明提供了一种从金银花提取物和中成药中鉴定是否掺杂有山银花的鉴定方法，其中，所述方法包括检测样品基因组DNA中是否存在山银花的关键SNP位点。当存在所述碱基时，鉴定待测样品中掺杂有山银花。

可选的，所述方法包括如下步骤：

1)以待测样品的基因组DNA为模板，对所述目的片段进行PCR扩增，获得扩增产物；

2)对扩增产物进行测序，拼接后去除引物区获得扩增片段，检测扩增片段中金银花SNP位点G/C是否存在所述SNP位点A/T，如果含有此位点，则证明金银花提取物或中成药中掺有山银花。

本发明对于PCR所使用的引物有特别的限制，仅为扩增出金银花和山银花，特异性较高，因此在PCR扩增的过程中为了达到目的条带的准确性，采用专门设计的特异引物。所述PCR扩增使用的引物为：

JYHF1 5′-AGTGGTGGTCGTAACATTC-3′

JYHR1 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

上述PCR扩增的反应程序为：

可选的，所述PCR扩增的反应体系为：

PCR Buffer(10×)2.5μL，Mg²⁺ 2μL(25mmol/L)，dNTPs混合物2μL(2.5mmol/L)，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 2μL(-约30ng)，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。

其中，所述待测样品包括金银花提取物以及主要成分为金银花的中成药品(胶囊，颗粒，药片和蜜丸)。

附图说明

图1所示为金银花和山银花四个基源的测序峰图文件，在SNP位点处，金银花为G和C，而山银花四个基源均为A和T。

图2所示为金银花和山银花不同比例混合粉末的测序峰图，金银花和山银花比例分别为15∶1(A)，1∶15(B)，4∶1(C)和1∶4(D)

图3所示为应用双峰法鉴定中成药和提取物的峰图文件，TQWS7为掺杂山银花的提取物，ZCY12-SW为首乌丸，ZCY16-QG为青果片，ACY17-KG为抗感颗粒。

具体实施方式

实施例1用于说明特异性引物扩增金银花和山银花的可行性

1)DNA的获取

从不同产地收集的金银花和山银花样品(包括灰毡毛忍冬，红腺忍冬，华南忍冬和黄褐毛忍冬)45份。分别取20mg药材，在MM400球磨仪(德国Retsch)上进行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA试剂盒提取总DNA。

2)PCR扩增

正向引物JYHF1 5′-AGTGGTGGTCGTAACATTC-3′

反向引物JYHR1 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

由赛百盛基因技术有限公司(北京)合成。引物用无菌去离子溶解并稀释至2.5μmol/μL。

25μL反应体系：PCR Buffer(10×)2.5μL，Mg2+ 2μL(25mmol/L)，dNTPs混合物2μL(2.5mmol/L)，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 1μL(-约30ng)，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。

PCR反应程序：在PCR仪上按照以下程序进行扩增反应：

3)测序

PCR产物直接测序。测序引物为正向引物JYHF1 5′-AGTGGTGGTCGTAACATTC-3′和反向引物JYHR1 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。为确保所扩增序列的可靠性，需要进行正反向测序或重复测序，然后将正反向测序结果进行拼接获得目的片段。

4)序列拼接

本实施例应用软件CodonCodeAligner 3.7.1(CodonCode Co.，Germany)进行序列拼接及校对。首先，进行测序质量评估及预处理，即去除测序结果两端的低质量部分，并对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼接，具体方法是：以20bp的窗口分别从序列5’端和3’端进行滑动，如果窗口内有多于2个碱基的Q值小于20，则删除一个碱基，窗口继续滑动，如果窗口内碱基Q值小于20的数目小于或等于2个，窗口停止滑动。

5)同属近缘种序列比对

用MEGA 5软件对测序并拼接后的各个样品以及GenBank中金银花，山银花ITS2序列进行比对，所有金银花的SNP位点均含有G，C两个碱基，山银花相同位点对应的碱基为A，T。(图1)

实施例2通过人工手段混合金银花和山银花药材粉末

将实施例1中的金银花和山银花药材粉末进行人工混合，所混合比例分别为金银花∶山银花为15∶1，1∶15，4∶1，和1∶4。提取混合药材粉末的DNA，应用特异引物JYHF1/JYHR1进行扩增并测序，在序列中查找相应的SNP位点。结果表明，混合粉末中金银花和山银花掺杂量的不同会对双峰的相应高度产生影响(图2)。在金银花∶山银花混合比例为15∶1和4∶1的峰图中(A，C)，含量高的金银花的SNP位点峰图高度明显高于含量较低的金银花SNP位点处的峰图高度。山银花掺杂情况反之亦然。(B为山银花∶金银花15∶1，D为山银花∶金银花4∶1)

实施例3金银花提取物中山银花成分的鉴定

采用与实施例1相同的方法进行鉴定，所不同的是以金银花提取物为样品，本次所选择的样品来自辽宁大连、陕西西安、以及湖南长沙。共计12批次，见表1。提取基因组DNA，应用特异引物JYHF1/JYHR1进行扩增并测序，在序列中查找对应的SNP位点(图3)。研究结果表明：11/12份金银花提取物中均检测到了金银花或山银花的SNP位点，7份掺杂两种药材，其中6份观察到双峰中山银花含量明显高于金银花，2份只检测到山银花SNP位点，只有2份只含有金银花，均来自辽宁大连(TQWS5，TQWS6)。说明应用此方法可以判断金银花提取物中是否掺杂山银花。

表1金银花提取物采样表

注：“+”代表有此成分，“++”表示以此成分为主注：“-”代表没有此成分

实施例4以金银花为主要成分中成药的鉴定

采用与实施例1相同的方法进行鉴定，所不同的是以含金银花的中成药(胶囊，颗粒，药片，蜜丸)为样品，见表2，这些样品85％在《中华人民共和国药典》中的检测标准都是以绿原酸计。提取中成药基因组DNA，应用特异引物JYHF1/JYHR1进行扩增并测序，在序列中查找相应的SNP位点，结果表明除去复方鱼腥草片之外其余的样品中成药都可以扩增出目的片段，其峰图中均可以找到金银花或山银花的SNP位点(图3)，且根据双峰得知，12份中成药中两种药材都有掺杂。4份中成药中金银花被山银花完全替换，分别为清开灵滴丸、羚羊感冒软胶囊、栀子金花丸和首乌丸，仅3份中成药用的是金银花正品，分别为金芪降糖片、连花清瘟胶囊和茵栀黄颗粒。

表2含金银花中成药取样表

注：“+”代表有此成分，“++”表示以此成分为主注：“-”代表没有此成分

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。