洛塞那肽及其类似物的制备方法与流程

本发明属于医药化学领域，具体涉及一种工业化大规模制备洛塞那肽的方法。

背景技术：

糖尿病是由多种病因引起的代谢紊乱疾病。根据国际糖尿病联盟(internationaldiabetesfederation，idf)统计，2012年全球糖尿病患者已超过3.71亿，死亡人数高达480万，估计到2030年全球将有近5.52亿患者。其中，ⅱ型糖尿病患者占90％以上。

聚乙二醇洛塞那肽是一种治疗ⅱ型糖尿病的长效降糖药物，由江苏豪森药业公司开发。已有结果表明它可实现一周一次给药，减少了给药频率，提高了病人的顺应性，是一种新型的长效降糖药。

聚乙二醇洛塞那肽以艾塞那肽作为阳性化合物，通过对天然存在的glp-1模拟肽ex-4(exenatide)进行修饰改造，使其在体内能进一步抵抗dpp-iv的快速降解。同时注意到很多蛋白类及多肽类药物经聚乙二醇(peg)修饰后能减轻药物的毒性及其抗原免疫性，延长药物在体内的半衰期及作用时间，提高其生物利用度，进而提高药物的治疗效果，在保证疗效的前提下，延长给药间隔，减少给药次数，提高病人的顺应性。聚乙二醇洛塞那肽在糖尿病经典模型动物上显示出良好的降血糖作用，具有明显的ii型糖尿病治疗作用，且能避免低血糖及体重增加的不良反应；已有临床试验结果表明，本品降糖效果明显，药效持续时间长，同时无明显毒副作用。

洛塞那肽是聚乙二醇洛塞那肽的关键中间体，是聚乙二醇洛塞那肽起到降糖作用的活性结构。

洛塞那肽是一个由39个氨基酸组成的多肽，具有如下结构：

his-d-ala-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-gln-nle-glu-glu-glu-ala-val-arg-leu-phe-ile-glu-trp-leu-lys-gln-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-cys-nh2seqnoid.1

其中，d-ala表示d型丙氨酸，-nh2为c端酰胺。

目前，鲜有关于洛塞那肽制备方法的报道。

仅在专利wo2006074600中，公开了使用多肽合成仪，小批量(0.25mmol)固相合成洛塞那肽的方法。该方法不适用于工业生产。

因此，本领域迫切需要开发出一种工艺稳定、适合规模化生产的洛塞那肽的制备工艺。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决上述问题，提供一种采用固相合成法制备洛塞那肽及其类似物的方法，可用于工业上大规模生产。

本发明的技术方案是通过下列方式实现的：

洛塞那肽及其类似物的制备方法：

(1)、以氨基树脂为原料，加入脱保护剂，脱除氨基树脂的保护基,所述氨基树脂的保护基为fmoc保护基；

(2)、将上步所得脱除fmoc保护基的树脂，采用逐一缩合的方式，按照肽序依次连接带有保护基的氨基酸，直至完成所有氨基酸缩合，缩合反应包括加入缩合剂，任选的，加入有机碱；

(3)、加入脱保护剂至步骤2所得产物中，脱除氨基酸的fmoc保护基，得到树脂肽；

(4)、上述步骤3所得的洛塞那肽或其类似物树脂肽经裂解液处理，去除树脂和保护基，冲析沉降得到洛塞那肽或其类似物的粗品；

(5)、粗品经纯化、冻干得精品。

本发明中，所用到的脱保护剂为哌啶的dmf溶液，浓度5％～50％，优选15％～25％。

根据本发明的制备工艺，步骤1中所用的氨基树脂为rinkamide-am树脂、rinkamide-mbha树脂或rinkamide-pega树脂。

根据本发明的制备工艺，步骤1氨基树脂载量为0.2～1.5mmol/g，优选0.5～1.0mmol/g。

根据本发明的制备工艺，制备得到的洛塞那肽树脂肽结构：

his(r)-d-ala-glu(otbu)-gly-thr(tbu)-phe-thr(tbu)-ser(tbu)-asp(otbu)-leu-ser(tbu)-lys(boc)-gln(trt)-nle-glu(otbu)-glu(otbu)-glu(otbu)-ala-val-arg(pbf)-leu-phe-ile-glu(otbu)-trp(boc)-leu-lys(boc)-gln(trt)-gly-gly-pro-ser(tbu)-ser(tbu)-gly-ala-pro-pro-pro-cys(trt)-氨基树脂，其中保护基r为fmoc、boc或trt。其中fmoc-his(trt)-oh缩合反应中，以3-(二乙氧基邻酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮作为缩合试剂和以n,n-二异丙基乙胺作为有机碱，不需控制其它条件，可显著控制d-his¹-洛塞那肽杂质。

根据洛塞那肽的制备工艺，制备洛塞那肽所用的氨基酸分别以下列形式应用：fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-nle-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-d-ala-oh、fmoc-his(r)-oh。其中保护基r为fmoc、boc或trt。

根据本发明的制备工艺，步骤2中所用的缩合剂选自1-羟基苯并三唑(hobt)、n,n-二异丙基碳二亚胺(dic)、n,n-二环己基碳二亚胺(dcc)、3-(二乙氧基邻酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮(depbt)、o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸酯(tbtu)、苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)的一种或多种；或者选自n,n-二异丙基碳二亚胺(dic)或3-(二乙氧基邻酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮(depbt)的一种或多种。

根据本发明的制备工艺，氨基酸与树脂的投料摩尔比为2：1～6:1。

根据本发明的制备工艺，步骤(2)中缩合温度为10～30℃。

根据本发明的制备工艺，步骤(2)中氨基酸缩合过程所用的有机碱选自n,n-二异丙基乙胺或三甲基吡啶。

根据本发明的制备工艺，步骤(4)中裂解液为三氟乙酸(tfa)、1,2-乙二硫醇(edt)或二硫苏糖醇(dtt)、三异丙基硅烷(tis)和水组成的混合物。

根据本发明的制备工艺，三氟乙酸(tfa)：1,2-乙二硫醇(edt)：三异丙基硅烷(tis)：水的质量比为85～94:2～5:2～5:2～5。

根据本发明的制备工艺，三氟乙酸(tfa)：二硫苏糖醇(dtt)：三异丙基硅烷(tis)：水的质量比为85～94:2～5:2～5:2～5。

根据本发明的制备工艺，步骤(4)中裂解液与洛塞那肽树脂肽的体积重量比5～20：1，单位为ml/g，或者为8～15:1，单位为ml/g。

根据本发明的制备工艺，步骤(4)中裂解反应时间为1～5小时，或者为2～4小时。

另一方面，本发明提供了一种洛塞那肽及其类似物的纯化方法。

根据本发明的制备工艺，步骤(5)中洛塞那肽粗品的纯化方法，使用高效液相反相纯化方法。纯化方法如下：

a.制备柱填料：c¹⁸/c⁸类填料。

b.纯化流动相：

流动相a：磷酸盐水溶液，ph范围2.0～7.0；流动相b：乙腈或甲醇。

c.脱盐流动相：

流动相c：水或三氟乙酸水溶液，浓度0～0.5％；流动相d：乙腈或三氟乙酸乙腈溶液，浓度0～0.5％。

纯化步骤如下：

1)称取洛塞那肽粗品，用水溶解。过滤后，上样。粗品水溶液/有机溶剂上制备柱吸附，体积比：100/0～50/50；

2)使用流动相a和流动相b梯度洗脱，收集目标组分；

3)将步骤2)所得制备液再次上制备柱吸附，使用流动相c和流动相d梯度洗脱，收集目标组分。

循环纯化，合并纯化液，减压浓缩后冻干，即得洛塞那肽精品。

本发明的优势在于提供了一种适合工业化生产的洛塞那肽及其类似物的固相合成方法，所得洛塞那肽精品质量稳定，纯度高，d-his¹-洛塞那肽杂质含量控制在较小范围。并且该工艺操作简单，所得产品质量稳定可靠，适于洛塞那肽的大规模工业生产。

附图说明

图1为实施例2洛塞那肽粗品中d-his¹-洛塞那肽杂质的hplc图谱；

图2为实施例5洛塞那肽精品有关物质的hplc图谱。

具体实施方式

为了进一步说明本发明的技术方案及其所取得的技术效果，下面将结合实施例来具体说明本发明的实施方案。但是，本发明并不限于具体实施例。

实施例1：洛塞那肽树脂肽的合成

称量120grinkamide-amresin(载量0.5mmol/g，60mmol)投入到反应器中，加入1.2l20％哌啶/dmf混合溶液，氮气鼓泡反应5～6分钟，抽干。再加入1.2l20％哌啶/dmf混合溶液，氮气鼓泡反应20～25分钟，抽干。树脂用1.2ldmf洗涤4次。

称量32.4ghobt(240mmol)、140.6gfmoc-cys(trt)-oh(240mmol)、30.3gdic(240mmol)溶解在0.6ldmf和0.6ldcm中，搅匀，将上述溶液加入到反应器中。控制反应温度20～25℃，反应约4小时，终点以茚三酮检测呈阴性为准，向反应器中加入1.2l20％哌啶/dmf混合溶液氮气鼓泡反应5～6分钟，抽干。再加入1.2l20％哌啶/dmf混合溶液，氮气鼓泡反应20～25分钟，抽干。树脂用1.2ldmf洗涤4次。

重复以上操作，逐一依次与相应的氨基酸类似物缩合，各氨基酸的用量与上述fmoc-cys(trt)-oh的用量相同。依次连接的氨基酸为：fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-nle-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-d-ala-oh。

称量98.74gdepbt(330mmol)、204.52gfmoc-his(trt)-oh(330mmol)用0.6ldmf和0.6ldcm溶解，加入85.30gdiea(660mmol)，搅匀，将上述溶液加入到反应器中。反应器夹层水浴温度控制在10～20℃，氮气鼓泡反应6小时，终点以茚三酮检测呈阴性为准。

向反应器中加入1.2l20％哌啶/dmf混合溶液氮气鼓泡反应5～6分钟，抽干。再加入1.2l20％哌啶/dmf混合溶液，氮气鼓泡反应20～25分钟，抽干。树脂用1.2ldmf洗涤4次，再用1.2l异丙醚洗涤4次。得洛塞那肽树脂肽510g。

实施例2：洛塞那肽粗品的合成

配置裂解液1l，其中三氟乙酸900ml，1,2-乙二硫醇50ml，三异丙基硅烷25ml，水25ml。降温至10～20℃。

取实施例1中所得的洛塞那肽树脂肽100g，加入到2l反应瓶中。加入配置好的裂解液，室温下搅拌反应3小时。过滤，滤液加入到10l乙醚中。静置后过滤，滤饼用乙醚洗涤。真空干燥得到洛塞那肽粗品45g。所得样品进行hplc检测，d-his¹-洛塞那肽杂质为0.79％。图谱如图1所示。

实施例3：洛塞那肽粗品的合成

配置裂解液1l，其中三氟乙酸900ml，二硫苏糖醇50g，三异丙基硅烷25ml，水25ml。降温至5～10℃。

取实施例1中所得的洛塞那肽树脂肽100g，加入到2l反应瓶中。加入配置好的裂解液，室温下搅拌反应3小时。过滤，滤液加入到10l乙醚中。静置后过滤，滤饼用乙醚洗涤。真空干燥得到洛塞那肽粗品46.8g，d-his¹-洛塞那肽杂质为0.71％，图谱如图1所示。

实施例4：洛塞那肽粗品的纯化

将实施例2中所得的洛塞那肽粗品20mg/ml的水溶液，过0.45um滤膜待用。

反相纯化色谱条件：

制备柱：250mm×100mmi.d.；

填料：c1810u

流动相a：0.1m磷酸盐水溶液，ph：6.0；流动相b：乙腈

将上述样品分次上样，梯度洗脱，合并收集目标组分。

将收集的纯化液，再次上柱，以0.1％三氟乙酸水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，收集目标组分。即得洛塞那肽纯品溶液。

实施例5：洛塞那肽的冻干

将实施例4所得的洛塞那肽纯品溶液。在小于40℃水浴条件下减压浓缩，去除有机溶剂后冻干，得洛塞那肽精品。纯度：99.62％，图谱如图2所示。

实施例6

按照实施例1和实施例2的方法进行洛塞那肽粗品合成，区别在于缩合反应使用的反应试剂为depbt/diea，经真空干燥得到洛塞那肽粗品50g，所得样品进行hplc检测，d-his¹-洛塞那肽杂质为0.62％。

实施例7

按照实施例1和实施例2的方法进行洛塞那肽粗品合成，区别在于，反应温度控制在0-5℃，经真空干燥得到洛塞那肽粗品35g，所得样品进行hplc检测，d-his¹-洛塞那肽杂质为0.68％。

实施例8

按照实施例1和实施例2的方法进行洛塞那肽粗品合成，区别在于，反应温度控制在50℃，经真空干燥得到洛塞那肽粗品40g，所得样品进行hplc检测，d-his¹-洛塞那肽杂质为1.16％。

实施例9

按照实施例1和实施例2的方法进行洛塞那肽粗品合成，区别在于，裂解液的体积为2l，洛塞那肽粗品粗品的量为100g，经真空干燥得到洛塞那肽粗品40g，所得样品进行hplc检测，d-his¹-洛塞那肽杂质为0.66％。

实施例10

按照实施例1和实施例2的方法进行洛塞那肽粗品合成，区别在于，裂解液的体积为0.5l，洛塞那肽粗品粗品的量为100g，经真空干燥得到洛塞那肽粗品25g，所得样品进行hplc检测，d-his¹-洛塞那肽杂质为0.86％。

实施例11

按照实施例1和实施例2的方法进行洛塞那肽粗品合成，区别在于第三十九位氨基酸类似物fmoc-his(trt)-oh缩合使用的缩合剂位dic/hobt，所得样品进行hplc检测，d-his¹-洛塞那肽杂质占洛塞那肽的4.22％。

对比fmoc-his(trt)-oh缩合使用两种缩合剂得到的粗品图谱，使用depbt/diea进行缩合，能控制d-his¹-洛塞那肽杂质在较小水平。

序列表

<110>江苏豪森药业集团有限公司

<120>洛塞那肽及其类似物的制备方法

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>39

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

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35