本发明属于藻类培养技术领域，提供了一种富硒小球藻的异样与自养结合的培养方法。
背景技术：
小球藻是一种重要的微藻资源，具有极其丰富的营养成分和优良的医疗保健作用。含有丰富的蛋白质、氨基酸、色素、多不饱和脂肪酸等,营养全面,是水产及畜牧养殖理想的饲料原料。其蛋白质含量50％～67％，其中含有人体所必须的20种氨基酸、多种维生素和微量元素，以及亚麻酸、亚油酸、类胡萝卜素等成分。小球藻中富含CGF(小球藻生长因子)，能迅速恢复养殖动物机体造成的损伤。小球藻中含有的生物活性物质糖蛋白、多糖体以及高达13％的核酸等物质具有显著的抑瘤抗癌、增强免疫及抗病毒感染的活性。
在水产养殖上，单细胞的小球藻可直接作为海水鱼育苗的水质调节以及轮虫、卤虫等海水鱼育苗活饵料的培育饵料，也可以用于海水鱼、海参、对虾等的饵料添加剂，具有很高的经济价值。
除了在水产养殖的应用，小球藻因其含有动物生长所需的蛋白质、碳水化合物、脂质、氨基酸、矿物质、维生素、虾青素、纤维素等四十多种营养物质，现在作为饲料或饲料添加剂被广泛应用于牲畜(如猪、鸡等)的饲养中，在动物饲料中添加小球藻能明显的提高动物的免疫力、成活率和产量，并能促进动物采食、提高生长速度和减少疾病。尤其可替代目前饲养动物所用的抗生素、抗菌素等药品，免除使用激素类物质作为饲料所造成的药物残留。
目前国内对小球藻的培养的主要是跑道式养殖池或袋式光合培养，这种培养方式受气候条件(温度、光照等)的影响比较大，而且易受敌害(轮虫、纤毛虫等)的侵袭，养殖产量低且难以稳定等。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的不足，而提出一种富硒小球藻的培养方法。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种富硒小球藻的培养方法，包括步骤如下：
(1)以小球藻为发酵藻种进行种子活化
活化培养条件为：摇床培养，转速80～200r/min、接种量5～10％、pH 6.5～7.5、温度为27～35℃、时间48～72h；种子活化分为三级，从低到高依照发酵所需量进行扩大培养；
(2)将活化后的藻种接种到发酵培养基中培养
发酵条件为：通光通气、pH 6.5～7.5、接种量5～10％、培养温度27～35℃、搅拌转速50～200r/min、培养时间90～120h。
所述活化培养基的组份：葡萄糖10～20g/L、柠檬酸0.002g/L、柠檬酸铁铵0.002g/L、Na2‐EDTA 0.0008g/L、K2HPO4 0.1g/L、MgSO4 0.03g/L、CaCL2·2H2O 0.03g/L、Na2CO30.01g/L、NaNO3 1～2g/L、微量元素溶液1mL/L。
微量元素溶液配方为每升含有：H3BO3 2.86g、MnCL2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O 0.222g、NaMoO4·2H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.04947g。
所述培养基配置需将葡萄糖与其他组份分开，115℃灭菌15分钟，冷却后混合使用。
发酵培养基的组份：葡萄糖10～40g/L、柠檬酸0.002～0.01g/L、柠檬酸铁铵0.002～0.01g/L、Na2‐EDTA 0.0008～0.0015g/L、K2HPO4 0.1～0.2g/L、MgSO4 0.03～0.04g/L、CaCL2·2H2O 0.03～0.04g/L、Na2CO3 0.01～0.03g/L、NaNO3 1～2g/L、亚硒酸钠2mg/L、微量元素溶液1mL/L。
微量元素溶液配方为每升含有：H3BO3 2.86g、MnCL2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O 0.222g、NaMoO4·2H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.04947g。
所述步骤(2)中发酵培养时，定时取样测定葡萄糖浓度，及时补加葡萄糖，通过补加葡萄糖的方式使发酵液中葡萄糖浓度不低于15g/L，并且48小时后增开光源。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明对培养基的配方及发酵条件进行了改进，并且通过添加光源及发酵补糖的方式为提高小球藻的产量提供了基础条件。
2、本发明通过在发酵培养基添加2mg/L的亚硒酸钠来达到小球藻内富硒的效果,小球藻硒浓度为66ug/g左右。
3、使用本发明方法后，富硒小球藻的藻体数显著提高，干重达到4.59g/L以上，比优化前的0.4729g/L至少提高了9.7倍，显著的提高了产量。为提高富硒小球藻的工业化发酵和相关营养品的开发提供了必要条件。
具体实施方式
以下对本发明实施做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。小球藻Chlorella sorokiniana NK‐01来源于南开大学生命科学学院。
一种富硒小球藻的培养方法，包括步骤如下：
(1)以小球藻Chlorella sorokiniana NK‐01为发酵藻种进行种子活化
其中，活化培养基的组份：葡萄糖10～20g/L、柠檬酸0.002g/L、柠檬酸铁铵0.002g/L、Na2‐EDTA 0.0008g/L、K2HPO4 0.1g/L、MgSO4 0.03g/L、CaCL2·2H2O 0.03g/L、Na2CO3 0.01g/L、NaNO3 1～2g/L、微量元素溶液1mL；
微量元素溶液配方(1L)：H3BO3 2.86g、MnCL2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O 0.222g、NaMoO4·2H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.04947g；
活化培养条件为：摇床培养，转速80～200r/min、接种量5～10％、pH 6.5～7.5、温度为27～35℃、时间48～72h；
种子活化分为三级：一级种子活化、二级种子活化、三级种子活化，从低到高依照接种量进行扩大培养。
培养基配置需将葡萄糖与其他组份分开，115℃灭菌15分钟，冷却后混合使用。
(2)将三级活化后的藻种接种到发酵培养基中培养
其中，发酵培养基的组份包括：葡萄糖10～40g/L、柠檬酸0.002～0.01g/L、柠檬酸铁铵0.002～0.01g/L、Na2‐EDTA 0.0008～0.0015g/L、K2HPO4 0.1～0.2g/L、MgSO4 0.03～0.04g/L、CaCL2·2H2O 0.03～0.04g/L、Na2CO3 0.01～0.03g/L、NaNO3 1～2g/L、亚硒酸钠2mg/L、微量元素溶液1mL；
微量元素溶液配方(1L)：H3BO3 2.86g、MnCL2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O 0.222g、NaMoO4·2H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.049g；
发酵条件为：通光通气、pH 6.5～7.5、接种量5～10％、培养温度27～35℃、搅拌转速100～200r/min、培养时间90～120h。
发酵过程中定时取样测定发酵液中残糖浓度，及时补加葡萄糖，且48后增开光源。
培养基配置需将葡萄糖与其他组份分开，115℃灭菌15分钟，冷却后混合使用。
实例1 50L发酵罐发酵培养
(1)种子活化：
种子活化采用的培养基组成及培养条件：葡萄糖10g/L、柠檬酸0.002g/L、柠檬酸铁铵0.002g/L、Na2‐EDTA 0.0008g/L、K2HPO4 0.1g/L、MgSO4 0.03g/L、CaCL2·2H2O 0.03g/L、Na2CO3 0.01g/L、NaNO3 1g/L、微量元素溶液1mL；
微量元素溶液配方(1L)：H3BO3 2.86g、MnCL2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O 0.222g、NaMoO4·2H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.049g；
活化条件：pH 6.5、温度27℃、时间48h、接种量5％。
活化为三级种子活化，逐级放大：从低到高每级装液量分别为：50mL(100mL三角瓶)，75mL(250mL三角瓶)，1500mL(5000mL三角瓶)；摇床培养，转速为100r/min；总活化时间为6d。
培养基灭菌需将葡萄糖与其他组份分别进行，葡萄糖经单独灭菌冷却后加入到已灭菌的其他组份中。
(2)发酵培养：
发酵过程采用的培养基组成及培养条件：葡萄糖10g/L、柠檬酸0.002g/L、柠檬酸铁铵0.002g/L、Na2‐EDTA 0.0008g/L、K2HPO4 0.1g/L、MgSO4 0.03g/L、CaCL2·2H2O 0.03g/L、Na2CO3 0.01g/L、NaNO3 1g/L、亚硒酸钠2mg/L、微量元素溶液1mL；
微量元素溶液配方(1L)：H3BO3 2.86g、MnCL2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O 0.222g、NaMoO4·2H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.049g；
发酵条件：pH 6.5、培养温度27℃、接种量5％、搅拌转速150r/min、通气量2m3/h，培养时间90h。
50L发酵罐，经空消及实消后，将活化好的小球藻接种到发酵培养基中培养，发酵液总体积为30L。
发酵罐中发酵培养基的实消需将葡萄糖与其他组份分开灭菌，冷却后混合于发酵罐中。
发酵过程分为前48h无光源和后42h增开光源。
发酵过程中每隔12h取样测定发酵液中残糖浓度，通过补加葡萄糖使发酵液中葡萄糖浓度不低于15g/L。
培养结束时富硒小球藻干重为4.59g/L，小球藻内硒浓度为68mg/Kg。
实例2 500L发酵罐发酵培养
(1)种子活化：
种子活化采用的培养基组成及培养条件：葡萄糖15g/L、柠檬酸0.002g/L、柠檬酸铁铵0.002g/L、Na2‐EDTA 0.0008g/L、K2HPO4 0.1g/L、MgSO4 0.03g/L、CaCL2·2H2O 0.03g/L、Na2CO3 0.01g/L、NaNO3 1.5g/L、微量元素溶液1mL；
微量元素溶液配方(1L)：H3BO3 2.86g、MnCL2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O 0.222g、NaMoO4·2H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.049g；
培养条件：pH值7.0、温度30℃、时间48h、接种量8％。
活化过程分为三级，逐级扩大，从低到高每级装液量为：160mL(250mL三角瓶)，2000mL(5000mL三角瓶)，24L(50L发酵罐)；一级和二级种子活化为摇床培养，转速为100r/min；三级为50L发酵罐培养，转速为150r/min，通气量1.5m3/h,总活化时间为6d。
培养基灭菌需将葡萄糖与其他组份分别进行，葡萄糖经单独灭菌冷却后加入到已灭菌的其他组份中。
(2)发酵培养：
将活化好的小球藻转接到发酵培养基中培养，发酵罐体积为500L，装液量为300L。
发酵培养基成份及培养条件：葡萄糖25g/L、柠檬酸0.006g/L、柠檬酸铁铵0.006g/L、Na2‐EDTA 0.001g/L、K2HPO4 0.15g/L、MgSO4 0.035g/L、CaCL2·2H2O 0.036g/L、Na2CO30.02g/L、NaNO3 1.5g/L、亚硒酸钠2mg/L、微量元素溶液1mL；
微量元素溶液配方(1L)：H3BO3 2.86g、MnCL2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O 0.222g、NaMoO4·2H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.049g；
发酵条件：pH 7.0、温度30℃、接种量8％、搅拌转速150r/min、通气量5m3/h，培养时间105h。
500L发酵罐中发酵培养基的灭菌为不含葡萄糖的其它发酵培养基组份，葡萄糖经在50L发酵罐中单独灭菌冷却后加入到已灭菌的发酵培养基中。
发酵过程分为前48h无光源和48h后增开光源。
发酵过程每隔12h取样测定发酵液中残糖浓度，通过补加葡萄糖的方式使发酵液中葡萄糖浓度不低于15g/L。
培养结束时富硒小球藻干重为4.82g/L，小球藻内硒浓度为66mg/Kg。
实例3 5000L发酵罐发酵培养
(1)种子活化：
种子活化采用的培养基组成及培养条件：葡萄糖20g/L、柠檬酸0.002g/L、柠檬酸铁铵0.002g/L、Na2‐EDTA 0.0008g/L、K2HPO4 0.1g/L、MgSO4 0.03g/L、CaCL2·2H2O 0.03g/L、Na2CO3 0.01g/L、NaNO3 2g/L、微量元素溶液1mL；
微量元素溶液配方(1L)：H3BO3 2.86g、MnCL2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O 0.222g、NaMoO4·2H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.049g；
培养条件：pH值7.5、温度35℃、时间72h、接种量10％。
活化过程分为三级，逐级扩大，从低到高每级装液量为：3000mL(5000mL三角瓶)，30L(50L发酵罐)，300L(500L发酵罐)；一级种子活化为摇床培养，转速为100r/min；二级为50L发酵罐培养，转速为150r/min，通气量1.5m3/h，三级为500L发酵罐培养，转速为150r/min，通气量3m3/h，总活化时间为6d。
培养基灭菌需将葡萄糖与其他组份分别进行，葡萄糖经单独灭菌冷却后加入到已灭菌的其他组份中。
(2)发酵培养：
将活化好的小球藻转接到发酵培养基中培养，发酵罐体积为5000L，装液量为3000L。
发酵培养基成份及培养条件：葡萄糖40g/L、柠檬酸0.01g/L、柠檬酸铁铵0.01g/L、Na2‐EDTA 0.0015g/L、K2HPO4 0.2g/L、MgSO4 0.04g/L、CaCL2·2H2O 0.04g/L、Na2CO3 0.03g/L、NaNO3 2g/L、亚硒酸钠2mg/L、微量元素溶液1mL；
微量元素溶液配方(1L)：H3BO3 2.86g、MnCL2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O 0.222g、NaMoO4·2H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.049g；
发酵条件：pH 7.5、温度35℃、接种量10％、搅拌转速70r/min、通气量50m3/h，培养时间120h。
发酵罐中发酵培养基的灭菌为不含葡萄糖的其它发酵培养基组份，葡萄糖经在500L发酵罐中单独灭菌冷却后加入到已灭菌的发酵培养基中。
发酵过程分为前48h无光源和48h后增开光源。
发酵过程每隔12h取样测定发酵液中残糖浓度，通过补加葡萄糖的方式使发酵液中葡萄糖浓度不低于15g/L。
培养结束时富硒小球藻干重为4.74g/L，小球藻内硒浓度为71mg/Kg。
上述三个实例中小球藻干重测定方法为：发酵结束后取100mL发酵液置入离心管中，依次离心、清水洗涤三次后，去除上清留沉淀，置于80℃烘箱中烘干称重，每次进行3个平行。