一种回收利用微藻藻渣用于生产富含多糖螺旋藻的方法与流程

本发明涉及微藻藻渣的回收利用和微藻培养，具体的说是通过水热处理将微藻藻渣中的氮源、碳源等营养物质回收并通过适当稀释用于螺旋藻培养生产富含多糖的生物质。可用于废弃物资源化利用、废水处理、螺旋藻培养及其生物质的生产以及以螺旋藻多糖为原料的食品、医药、能源等相关领域。

背景技术：

螺旋藻多糖是螺旋藻细胞内的一种水溶性多糖，具有抗肿瘤、抗辐射、抗突变等生物活性，能提高机体细胞和体液的免疫功能，抵制癌细胞增殖，减轻辐射所引起的遗传损伤等，在防癌、抗衰老、增强机体免疫力等方面具有广阔的应用前景。此外，螺旋藻多糖主要由葡萄糖残基连接而成，经过水解后可用于发酵法生产生物乙醇、生物丁醇、生物氢、甲烷等生物能源，因此在微藻生物能源领域具有潜在应用价值。然而螺旋藻培养需要消耗大量营养盐，而营养盐的生产本身会消耗大量能量并释放温室气体CO₂，造成环境污染。此外，大量的营养盐需求(尤其是氮源)将使得微藻培养与农业生产形成营养盐竞争，不利于微藻培养的可持续性。

微藻经过热水提取水溶性活性物质或经过有机溶剂萃取提取油类物质作为生物能源原料后的藻渣含有不溶性蛋白质、多糖等有机物质和铁、镁、硫、磷等营养元素，经过进一步水热处理得到氨基酸、多肽、氨氮、碳水化合物和矿物元素等物质可以作为微藻生长所需的氮源、碳源和微量元素来源。利用水热处理液进行微藻培养，不仅回收利用了碳氮磷及矿物质等营养物质，降低营养盐的消耗成本，同时也能减少废物排放量，降低因直接排放而导致水体富营养化的风险，具有良好的经济和环境效益。

藻渣水热处理的方法主要有酸热液化(Hydrothermal acid liquefaction)、中性水热液化(Hydrothermal liquefaction)和水热碳化(Hydrothermal carbonization，HTC)。酸热水解液化所需温度为100～110℃，常压下进行回流即可，但需要加入盐酸、硫酸或有机酸等，对设备耐腐蚀要求较高，不宜规模放大。水热液化通常在250～400℃下进行，温度较高，压力较大，对能量输入和设备要求较高。水热碳化通常在150～225℃下进行，温度和压力均较适中，有利于工业放大。水热碳化的固相残渣中含有丰富的油脂和水热碳，可以作为生物柴油和生物碳的原料。水热碳化处理液中含有少量氨氮和大量有机氮源如氨基酸等，同时含有糖类、有机酸等碳源，在氮限制下大量有机氮源可以减慢螺旋藻对氮的吸收速率而积累大量多糖。因此HTC处理液是理想的螺旋藻多糖生产的营养来源。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种回收利用微藻藻渣中的氮源、碳源和其他营养元素生产富含多糖螺旋藻的方法。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

利用水热碳化回收微藻藻渣中的营养物质至水热碳化液，藻渣中75％以上的氮被回收；利用水热碳化液回收的氮源、碳源和其他营养元素，完全替代常规的营养盐(如硝酸钠、尿素等)生产富含多糖的螺旋藻，其生物质中多糖含量达到65％以上，比常规的培养基提高15％～56％，多糖产率比常规的培养基提高23％到3.5倍；同时利用螺旋藻生产多糖的过程可以清除水热碳化液中80％以上的无机氮和45％以上的有机氮。可按如下步骤具体操作：

1)藻渣的水热碳化

将微藻藻渣与水充分混合搅拌浸润后，调节固液质量比1:8～1:30置于不锈钢高压反应釜中，密封，通入氮气吹扫2min以保持惰性氛围；以1～3℃/min的速度加热反应釜从室温至195℃～210℃，恒温2h～4h；用冷却循环水以2～6℃/min的速度冷却反应釜至室温，打开放气阀释放残余气体，将反应液与固相残渣分离，用0.01-2倍反应液体积的水清洗固相残渣，并收集合并固液分离后的反应液和清洗液，得到水热碳化液；

步骤1)所述的微藻藻渣可以为冷冻干燥、喷雾干燥或太阳下自然晒干的干燥固体，也可以为湿藻渣浆；微藻藻渣来自于下述方法中的一种或二种以上混合：1)微藻经过水浸提后固液分离得到的固体藻渣；2)微藻经过有机溶剂萃取后固液分离得到的固体藻渣；3)微藻先经过水浸提后固液分离得到的固体A、固体A再经过有机溶剂萃取后固液分离得到的固体藻渣；4)微藻先经过有机溶剂萃取和固液分离得到的固体A，固体A再经过水浸提后固液分离得到的固体藻渣；所述有机溶剂为氯仿、正己烷、甲醇和乙醇中的一种或二种以上；所述微藻为螺旋藻、集胞藻、聚球藻、湛江等鞭金藻、亚心形四爿藻、微拟球藻、三角褐指藻、莱茵衣藻、小球藻、雨生红球藻、栅藻、绿球藻中的一种或二种以上；

步骤1)所述与微藻藻渣混合的水和清洗反应固相残渣的水可以为自来水、地下水、纯净水或蒸馏水，也可以为微藻培养收获后的废水、水提分离纯化水溶性活性物质和生物能源原料后的残余废水中的一种或二种以上的混合。

步骤1)所述的反应液与固相残渣分离的方法为重力过滤、膜过滤、离心中的一种或二种以上的组合。

2)水热碳化液作为营养液培养螺旋藻

将螺旋藻藻种液经离心或过滤洗涤后得到的藻泥接入无机盐培养基中，并调整初始接种密度OD₅₆₀为0.3～0.5；或原螺旋藻藻种液经无机盐培养基直接稀释至初始接种密度OD₅₆₀为0.3～0.5；向接种后的藻液中添加水热碳化液，使藻液培养基中的初始总氮浓度控制在10～30mg/L；温度20～35℃，pH值8～12，自然条件下光照或人工光暗比12h:12h～24h:0h光照，培养液受光面光照强度30～3000μmol/(m²·s)，培养至对数生长后期或稳定期收获螺旋藻细胞。

步骤2)所述无机盐培养基中每升水体含：NaHCO₃ 3～20g，NaNO₃ 0～18mg，KCl 0～1g，MgSO₄·7H₂O 0～0.1g，CaCl₂·2H₂O 0～0.1g，H₃PO₄(85％w/w)0～0.1g，FeSO₄·7H₂O 0～0.05g，H₃BO₃ 0～3mg，MnCl₂·4H₂O 0～2mg， Na₂MoO₄·2H₂O 0～0.5mg，ZnSO₄·7H₂O 0～0.3mg，CuSO₄·5H₂O 0～0.3mg。

步骤2)所述螺旋藻藻种液为采用上述无机盐培养基或Zarrouk培养基培养得到的螺旋藻液，也可以是经过步骤2)所述的培养至对数生长后期或稳定期收获的螺旋藻液，螺旋藻液中的螺旋藻其蛋白质含量占干重的20％～70％，碳水化合物含量占干重的5％～70％，其余成分主要为脂质、核酸和灰分。

步骤2)所述无机盐培养基的水体来源为天然盐碱水、地下水、自来水或经步骤2)所述的藻细胞收获后的废水中的一种或二种以上的混合。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1.提高氮源利用率，节约螺旋藻培养成本：利用水热碳化回收微藻藻渣中的营养物质，氮回收率达到75％以上；以水热碳化液作为螺旋藻培养的氮源、碳源和其他营养元素，可以完全替代常规的营养盐供给(如硝酸钠、尿素等)，降低营养盐消耗成本，提高单位营养盐投入的产品产出；同时将藻渣进行废物资源化循环利用，有利于提高元素的利用效率，实现“原子经济”。

2.螺旋藻多糖产率和含量明显提高：利用添加了适当稀释的水热碳化液的培养基培养螺旋藻，生物质中多糖含量比常规的培养基(如添加硝酸钠)提高15％～56％，多糖产率提高23％到3.5倍。

3.螺旋藻生产的可持续性好：利用天然盐碱水培养并循环利用采收废水，可以节约淡水资源，减少污水排放，降低因直接排放而导致水体富营养化的风险，同时可以在不适合粮食种植和人类居住的碱湖附近进行培养，不占用耕地，具有良好的经济和环境效益。

4.实现含氮废水的高效处理：本发明涉及的螺旋藻培养过程可以清除培养水体中80％的氨氮和硝态氮以及超过45％的有机氮，在废水处理领域具有广泛的应用前景。

总之，本发明实现了废物的资源化利用，减少了营养盐消耗，在提升螺旋藻多糖产率和品质的同时节约了生产成本，同时有利于简化下游加工操作，促进螺旋藻的产业化生产，可广泛应用于以螺旋藻多糖为原料的食品、医药、能源等相关领域。

附图说明

图1为以高蛋白质低碳水化合物含量(蛋白质含量42％、碳水化合物含量16％)的螺旋藻为藻种，利用水热碳化液作为氮源和部分碳源在氮限制条件下培养螺旋藻所获得的多糖含量和产量。

图2为以低蛋白质高碳水化合物含量(蛋白质含量22％、碳水化合物含量53％)的螺旋藻为藻种，利用水热碳化液作为氮源和部分碳源在氮限制条件下培养螺旋藻所获得的多糖含量、产量和氮清除效率。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法和结果进行说明。本发明将经过水提或有机溶剂萃取后的微藻藻渣进行水热碳化，得到的水热碳化液(HTC aqueous phase,HTCAP)经过适当稀释得到一定总氮浓度的培养基，用于螺旋藻的培养 并生产富含多糖的生物质。

实施例1

以高蛋白质低碳水化合物含量(蛋白质含量42％、碳水化合物含量16％)的螺旋藻为藻种，利用水热碳化液作为氮源和部分碳源在氮限制条件下培养螺旋藻，生产富含多糖的生物质。

1)在2L不锈钢高压反应釜内，加入1.8L去离子水，将在80℃热水下提取4h后的高糖螺旋藻(碳水化合物含量44％)藻渣180g缓慢加入反应器中，得到固液质量比为1:10的均匀藻浆。密封反应器，通入氮气吹扫2min以保持惰性氛围。以1.5℃/min的速度加热反应釜至200℃，恒温3h。用冷却循环水以3℃/min的速度冷却反应釜至室温。打开放气阀释放残余气体，将反应液用300目的尼龙纤维布过滤，并用300mL去离子水清洗反应器和滤饼，收集滤液得到HTCAP，其总氮浓度达到5741mg/L，氮回收率为78％，-20℃冻存。

2)螺旋藻藻种细胞在营养丰富的培养基(Zarrouk)中培养，培养基用去离子水配制，每升水体含：NaHCO₃ 16.8g，K₂HPO₄ 0.5g，NaNO₃ 2.5g，K₂SO₄ 1g，NaCl 1g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，CaCl₂·2H₂O 0.04g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，H₃BO₃2.86mg，MnCl₂·4H₂O 1.86mg，ZnSO₄·7H₂O 0.22mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.39mg，CuSO₄·5H₂O 0.08mg。初始接种密度OD₅₆₀为0.3，培养温度26～30℃，人工光暗比14h:10h，培养液受光面光照强度40μmol/(m²·s)，培养6天至对数生长期，用300目的尼龙纤维布过滤得到藻泥，用50mL无机盐培养基(MSM，去离子水配制，每升水体含：NaHCO₃ 6g，KCl 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.03g，CaCl₂·2H₂O 0.04g，H₃PO₄(85％w/w)0.03g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，H₃BO₃ 2.86mg，MnCl₂·4H₂O 1.86mg，ZnSO₄·7H₂O 0.22mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.39mg，CuSO₄·5H₂O 0.08mg)洗涤2次后重悬于MSM中，调整初始接种密度OD₅₆₀为0.3，向藻液中加入水热碳化液，控制初始总氮浓度在15mg/L，并以相同总氮浓度的NaNO₃为对照；温度25℃，pH值8～9，人工光暗比14h:10h，培养液受光面光照强度40μmol/(m²·s)，培养至第6天收获。

由图1可以看出，利用稀释后的HTCAP作为氮源和部分碳源，在氮限制的条件下进行混合营养(mixotrophic)培养螺旋藻，6天内多糖平均含量和产率分别达到73％和81mg/L/d，比常规用NaNO₃作为氮源进行光合自养(photoautotrophic)培养分别提高15％和23％。

此实施例说明，利用HTC回收热水提取后的螺旋藻藻渣中的氮源和碳源，在氮限制条件下利用HTCAP完全替代常规硝态氮源，以高蛋白质低碳水化合物含量的螺旋藻为藻种进行培养，其多糖含量和产率均明显提高。

实施例2

以低蛋白质高碳水化合物含量(蛋白质含量22％、碳水化合物含量53％)的螺旋藻为藻种，利用水热碳化液作为氮源和部分碳源在氮限制条件下培养螺旋藻，生产富含多糖的生物质，同时清除培养基中的大部分氨氮和部分有机氮。

1)水热碳化回收藻渣中的营养物质过程与实施例1相同。

2)螺旋藻藻种螺旋藻藻种细胞在营养胁迫的无机盐培养基(MSM)中培养，控制初始NaNO₃浓度为85mg/L，初始接种密度OD₅₆₀为0.3，培养温度26～30℃，人工光暗比14h:10h，培养液受光面光照强度40μmol/(m²·s)，培养6天后藻细胞处于氮饥饿状态，用300目的尼龙纤维布过滤得到藻泥，用50mL无机盐培养基(MSM)洗涤2次后重悬于MSM中，调整初始接种密度OD₅₆₀为0.3，向藻液中加入水热碳化液，控制初始总氮浓度在15mg/L，并以相同总氮浓度的NaNO₃为对照；温度25℃，pH值8～9，人工光暗比14h:10h，培养液受光面光照强度40μmol/(m²·s)，培养至第3天收获。

由图2可以看出，利用稀释后的HTCAP作为氮源和部分碳源，在氮限制的条件下进行混合营养(mixotrophic)培养螺旋藻，3天内多糖平均含量和产率分别达到65％和58mg/L/d，比常规用NaNO₃作为氮源进行光合自养(photoautotrophic)培养分别提高56％和3.6倍。氨氮的清除率达到总氮(TN)的80.4％，有机氮的清除率达到47.0％。

此实施例说明，利用HTC回收热水提取后的螺旋藻藻渣中的氮源和碳源，在氮限制条件下利用HTCAP完全替代常规硝态氮源，以低蛋白质高碳水化合物含量的螺旋藻为藻种进行培养，其多糖含量和产率均明显提高的同时可以清除80％以上的氨氮和45％以上的有机氮，在废水处理领域具有广泛的应用前景。