一种以SGLT2蛋白为靶点的抗糖尿病药物筛选细胞模型及其制备和应用的制作方法

本发明属于生物医药工程技术领域，具体涉及一种以SGLT2蛋白为靶点的抗糖尿病药物筛选细胞模型及其制备和应用。

背景技术：

糖尿病主要分为I型糖尿病和II型糖尿病，前者是由于胰岛β细胞不能产生足够的胰岛素(胰岛素绝对缺乏)所致，后者是由于胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗(胰岛素相对缺乏)所致。糖尿病患者中约有90％～95％属于II型糖尿病。

钠-葡萄糖协同转运蛋白(SGLT)是一类在小肠粘膜(SGLT1)和肾近曲小管(SGLT2和SGLT1)中发现的葡萄糖转运基因家族。SGLT2是一种低亲和力的转运系统，其在肾脏中特异性的表达并且在近曲小管的肾脏血糖重吸收中发挥非常重要的作用。约90％的葡萄糖通过近曲小管S1段SGLT2的作用被重吸收，因此，选择性地抑制SGLT2蛋白的活性，是一种创造性的治疗策略，即通过增加尿糖的排出以治疗II型糖尿病。

近年来，新机制降糖药物钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂所受关注日益增加，目前研究发现SGLT2抑制剂可通过降低肾脏葡萄糖重吸收而改善糖尿病患者高血糖状态，更有研究提示抑制SGLT2有潜在改善肾脏功能的作用。

药物筛选模型是寻找和发现新药物的重要条件之一。目前抗肿瘤药物的筛选方法主要在包括体内和体外筛选方法，体内筛选方法成本高，操作难度大，不利于高通量的药物筛选；体外筛选方法主要是在分子和细胞水平上实现的，具有材料用量少，作用机制明确，易用于大规模筛选等优点，是药物筛选的主要方法。

目前，针对SGLT2抑制剂药物筛选的细胞模型鲜有报道，通过已有模型对葡萄糖摄取的检测，存在背景高，灵敏度低等不足。因此，有必要建立良好的基于SGLT2抑制剂药物筛选细胞模型。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种以SGLT2蛋白为靶点的抗糖尿病药物筛选细胞模型及其制备和应用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开了一种以SGLT2蛋白为靶点的抗糖尿病药物筛选细胞模型，该细胞模型是以具有组成型活性的慢病毒颗粒为基础，感染panc-1细胞，构建得到；所述具有组成型活性的慢病毒颗粒为带有人源SGLT2基因、报告基因以及筛选基因的慢病毒颗粒。

所述报告基因为绿色荧光蛋白eGFP，其与人源SGLT2基因通过T2A连接。

所述筛选基因为嘌呤毒素puro，通过EF1启动子启动。

所述慢病毒颗粒为PCDH慢病毒包装系统，该慢病毒颗粒浓缩后滴度为5*10⁸TU/ML。

panc-1细胞来源于ATCC。

本发明还公开了上述以SGLT2蛋白为靶点的抗糖尿病药物筛选细胞模型的构建方法，包括以下步骤：

1)运用慢病毒颗粒携带基因与宿主基因组的随机整合技术，将人源SGLT2基因、报告基因以及筛选基因整合到panc-1细胞基因组中；

2)通过报告基因的表达量和筛选基因的筛选双重控制，确保目的蛋白SGLT2在目的细胞panc-1中高效表达，从而建立抗糖尿病药物筛选细胞模型。

本发明还公开了上述以SGLT2蛋白为靶点的抗糖尿病药物筛选细胞模型在筛选抗糖尿病药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开的以SGLT2蛋白为靶点的抗糖尿病药物筛选细胞模型，是通过慢病毒建立的稳定高表达目的蛋白(SGLT2)的细胞模型，与转染和同源重组相比，提高了基因整合效率，缩短了筛选时间；该模型通过绿色荧光蛋白(eGFP)的表达和筛选基因(puro)的筛选(嘌呤霉素)双重控制，更好保证了目的蛋白(SGLT2)在目的细胞(panc-1)中的高表达水平。Western-Blot对目的蛋白(SGLT2)检测结果显示，和对照细胞相比(空载病毒感染的细胞)，目的蛋白(SGLT2)表达量显著提高；该模型采用的panc-1细胞，自身葡萄糖摄取量低，而构建成细胞模型后，糖摄取结果显示，和对照细胞相比(空载病毒感染的细胞)，糖摄取量提高了5.2倍。

附图说明

图1为所构建载体基本骨架图；

图2为慢病毒包装结果图；

图3为panc-1细胞模型筛选后结果图；

图4为Western-Blot结果图；

图5为糖摄取结果图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明的抗糖尿病药物筛选细胞模型的构建方法，运用慢病毒携带基因与宿主基因组随机整合技术，将SGLT2基因、报告基因及筛选基因整合到panc-1细胞基因组中，通过绿色荧光蛋白(eGFP)的表达量和筛选基因(puro)的筛选(嘌呤霉素)双重控制，确保目的蛋白(SGLT2)在目的细胞(panc-1)中稳定的高效的表达，从而建立药物的筛选平台。

本发明的抗糖尿病药物筛选细胞模型，通过Western-Blot技术对目的蛋白(SGLT2)检测，结果显示，和对照细胞相比(空载病毒感染的细胞)，目的蛋白(SGLT2)表达量显著提高。

本发明的抗糖尿病药物筛选细胞模型，通过糖摄取检测试剂盒检测其对葡萄糖的摄取量。结果显示，和对照细胞相比(空载病毒感染的细胞)，糖摄取量提高了5.2倍，满足后续的药物筛选。

1、载体构建

参见图1，将人工合成的SGLT2基因，通过Not I和N he I酶切位点，利用双酶切、胶回收、连接、转化等技术，将目的基因(SGLT2)插入到慢病毒表达载体上(该载体包含eGFP-EF1-PURO基因)，命名为PCDH-SGLT2-eGFP-PURO，构建成功后通过测序确保正确无误。利用质粒大提试剂盒提取无内毒素、高浓度质粒。

所述的人源SGLT2基因序列为生工生物工程(上海)股份有限公司合成(序列来源：NCBI Reference Sequence:NM_003041.3)。具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、慢病毒包装

1)转染前一天，以合适的细胞密度接种HEK293细胞到10cm培养皿中。转染时，细胞达到90～95％的融合；

2)利用脂质体将PLP1，PLP2，PMDG与PCDH-SGLT2-eGFP-PURO质粒共转染HEK293细胞，于37℃，5％的CO₂培养箱中孵育；

3)48h后荧光显微镜检测转染效率(参见图2)；

4)48h后收获细胞上清，3000rpm离心15min，0.45um滤器过滤，每3体积上清加入1体积PEG，4℃过夜；

3000rpm离心，弃上清，加入100ul PBS溶解沉淀，并测定病毒滴度，分装-80℃保存。包装的病毒命名为V-SGLT2(目的病毒)和V-control(空载病毒)。

3、慢病毒感染

将包装好的慢病毒同时感染HEK293和panc-1细胞，48h后加入嘌呤霉素筛选，筛选稳定后通过流式细胞仪分选出eGFP表达高的细胞，于37℃，5％的CO₂培养箱中扩大培养。V-SGLT2感染panc-1的细胞命名为SGLT2pane-1，V-control感染panc-1的细胞命名为control panc-1，V-SGLT2感染HEK293的细胞命名为SGLT2HEK293，V-control感染HEK293的细胞命名为control HEK293，结果参见图3。

4、Western-Blot检测

收集1*10⁷个筛选稳定的细胞系(SGLT2pane-1与control panc-1)，经过RIPA裂解、SDS-PAGE电泳、转膜、抗体孵育、显色等步骤，检测目的蛋白(SGLT2)的表达情况。结果见图4，图中，control panc-1为空载病毒感染细胞，SGLT2pane-1为模型组细胞，SGLT2为目的蛋白，β-actin为内参蛋白，结果显示和对照细胞相比，模型组细胞中，目的蛋白(SGLT2)表达量明显提高。

5、糖摄取检测细胞模型的葡萄糖摄取量

利用糖摄取检测试剂盒分别对panc-1细胞模型(实验组和空载组)与HEK293细胞模型(实验组和空载组)葡萄摄取量进行检测，结果见图5，图中，SGLT2pane-1为panc-1细胞模型组，control panc-1为panc-1细胞对照组，SGLT2HEK293为HEK293细胞模型组，control HEK293为HEK293细胞对照组。结果显示，panc-1细胞模型组，和对照细胞相比，葡萄糖摄取量提高了5.2倍；HEK293细胞模型组只提高了2.0倍，说明panc-1细胞模型组更适合做药物筛选细胞模型。

核苷酸序列表

<110> 陕西脉元生物科技有限公司

<120>一种以SGLT2蛋白为靶点的抗糖尿病药物筛选细胞模型及其制备和应用

<160> 1

<210> 1

<211> 2019

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

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cttctgggca tcaccatgat ttacacggtg acaggagggc tggccgcgct gatgtacacg 600

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