一种永生化罗非鱼巨噬细胞系的建立及鉴定方法与流程

本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及一种永生化罗非鱼巨噬细胞系的建立及鉴定方法。
背景技术：
：鱼类巨噬细胞的形态和功能与哺乳动物的类似，在识别、吞噬病原微生物、处理和呈递抗原、激活淋巴细胞启动特异性免疫应答以及分泌免疫因子等方面发挥重要作用。鱼类巨噬细胞的活性与功能是反映和评价鱼类集体免疫水平的重要指标，对其活性与功能进行测定已成为鱼类免疫学、免疫毒理学、免疫药物筛选等研究的重要内容。自成功从金鱼前肾中分离并鉴定巨噬细胞系以来，相继有多种鱼的巨噬细胞系得以建立，并广泛进行了体外免疫功能指标如吞噬活性、趋化性、产生活性氧及一氧化碳等研究，但大部分研究对象主要为鲈鱼、鲷鱼、鲶鱼和鲤鱼等鱼类。罗非鱼是世界水产业重点培养淡水养殖鱼类，在水产养殖业中占重要地位，但目前对罗非鱼巨噬细胞免疫活性的相关研究较少，虽然有学者已经成功从罗非鱼头肾和腹腔中分离巨噬细胞，但未能获得具有单一克隆特性的能稳定传代培养的罗非鱼巨噬细胞系，使得相关免疫学研究停滞不前。然而，中国是罗非鱼养殖的主要国家，近几年罗非鱼链球菌病却严重危害着我国罗非鱼养殖及相关产业，每年造成的经济损失高达数亿美元。病害的暴发与随之而来的产品安全问题已成为制约我国罗非鱼产业发展的瓶颈。目前的药物只能在发病早期控制病情，但耐药和抗药性却不断产生和积累，急需有效的疫苗防制措施。目前的研究表明罗非鱼链球菌HSP70-肽疫苗在实验室获得了较高的免疫保护率(约78.0％)，而这有赖于罗非鱼巨噬细胞与HSP70的相互作用，但目前尚未能阐述获得高保护率的重要机制，这就需要首先获得单一克隆特性的能稳定传代培养的罗非鱼巨噬细胞系。基于此，本发明在分离纯化罗非鱼腹腔巨噬细胞的基础上，利用EBV病毒感染巨噬细胞，通过筛选单克隆细胞的方法，经传代稳定性、体外增殖、端粒酶活性、核型及特异性基因检测等实验鉴定，获得了能连续传代且功能确切的永生化罗非鱼巨噬细胞系。技术实现要素：本发明的目的是为获得单一克隆特性的能稳定传代培养的罗非鱼巨噬细胞系及为罗非鱼养殖提供一种稳定有效的疫苗，提供一种永生化罗非鱼巨噬细胞系的建立方法和鉴定方法。为实现本发明目的所使用的技术方案为：一种永生化罗非鱼巨噬细胞系的建立方法，具体步骤如下：1)挑选体重为100g±5g健康尼罗罗非鱼，于28-30℃水温条件下在充气水族箱中饲养，正常喂食7天后，对每尾罗非鱼腹腔注射250μL角鲨烯，每隔2天注射相同剂量角鲨烯，连续注射3次，并于分离细胞前一天停止喂食；2)在注射角鲨烯第7天后，使用100mg/L的MS-222麻醉试验鱼，75％酒精消毒体表；再用预冷的PBS冲洗腹腔，收集冲洗液于45ml离心管中，300g、4℃离心10min；吸去上清，细胞沉淀用HBSS重悬，300g、4℃离心10min洗涤1次；细胞重悬于2mlHBSS，加入9ml灭菌三蒸水作用20s破裂红细胞，立即加入1ml10×HBSS；300g、4℃离心10min，HBSS洗涤2次，最后用L-15培养基重悬细胞，进行稀释后台盼蓝染色，计算活细胞数，瑞氏染色观察细胞状态；然后分别用含100IU/ml氨苄青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、10％FBS的L-15培养基调整细胞密度约为1×106个/ml，于12孔板中28℃培养24h后吸去悬浮细胞，加入新培养基继续培养；在不同培养时间，吸去培养上清，加入瑞氏染色液染色5-10min，PBS洗涤2次，于倒置显微镜下观察细胞形态；3)将细胞消化后铺至96孔板中，每孔100uL已转染的细胞悬液，将培养板在培养箱孵育30min后，向每孔加入10μLMTT溶液；将培养板在培养箱内孵育1-4小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，得罗非鱼巨噬细胞；4)将B985细胞置于L15培养基+10％胎牛血清+1％双抗于28℃培养箱培养；B958细胞大规模培养至10-15ml后，停止加培养液至培养液完全变黄，得EB病毒，备用；5)收集步骤4)培养液，4℃、4000r/min离心30min：转移上清至另一无菌离心管；4℃、12000r/min离心120min，弃上清，加入5mL新鲜培养液反复吹打重悬，4℃、3000r/min离心20min，将上清用0.22μm一次性过滤器过滤得到EBV浓缩液，以1mL/管无菌分装后于-70℃保存；6)罗非鱼巨噬细胞生长至60％面积后，用步骤5)EBV浓缩液感染，感染3次，每次间隔2d，每次感染前将细胞置于4℃1.5-3h，向每皿加入1×108个EBV，28℃孵育10h后，换新鲜培养液；7)感染3次后的罗非鱼巨噬细胞亚克隆至96孔板，挑取单克隆细胞至24孔板中于培养箱中继续培养，选取状态好的细胞扩大培养至10cm皿并于液氮容器中冻存，得EBV病毒罗非鱼巨噬细胞；8)将EBV病毒罗非鱼巨噬细胞从液氮容器中取出，立即将细胞冻存管直接浸入37℃水浴中，在1-2分钟内摇动细胞冻存管至冻存的细胞完全融化，再放入水平低速离心机，600rpm/min离心5分钟后，用75％酒精消毒细胞冻存管后，小心打开盖子，弃掉冻存液后使用1mL完全培养液重悬细胞，将细胞重悬液接种到细胞培养皿中，28℃培养箱中静置培养24小时后，更换一次10％FBS-L15完全培养液，继续在培养箱中培养，细胞汇合度达90％时按每孔2ml接种于24孔细胞培养板中传代培养；9)将步骤8)细胞用胰酶或EDTA消化，传代至3-4代后，继续传代培养，每3天进行一次传代，连续传代培养30代，在显微镜下观察细胞形态变化，得永生化罗非鱼巨噬细胞；10)将永生化罗非鱼巨噬细胞消化后铺至96孔板中，每孔100uL细胞悬液，将培养板在培养箱孵育30min，向每孔加入10μLMTT溶液，将培养板在培养箱内孵育1、3、5、7、9和11天，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，得永生化罗非鱼巨噬细胞系。优选的，所述步骤4)的双抗由100U/mL青霉素和100U/mL链霉素组成。优选的，所述的步骤4)停止加培养液时间为5-8天。优选的，将以上建立的永生化罗非鱼巨噬细胞系经过端粒酶活性、核型和特异性基因检测。优选的，所述的端粒酶活性检测使用的引物为：Forwardprimer序列:5’-ATTCCTTCGGACAGCGTAA-3’Reversedprimer序列:5’-GAGGACTTACTCTTACACTTCGCTCACC-3’。一种如以上所述的永生化罗非鱼巨噬细胞系的应用。本发明有益效果为：通过本发明方法建立的永生化罗非鱼巨噬细胞系可连续传代，迄今已传代30代，且细胞能维持良好生长状态，可以对其进行冷冻保存，能提供大量的来源细胞。所建立的巨噬细胞系为开展病原特性及其致病机理研究、疫苗研制以及功能基因研究等相关领域的理论与应用研究提供了便利。附图说明图1是腹腔罗非鱼巨噬细胞分离培养的显微镜照片结果，其中A为培养24小时分离的腹腔罗非鱼巨噬细胞，m和g分别代表巨噬细胞和粒细胞。B、C、D分别代表巨噬细胞培养24、48和72小时的细胞形态。E和F分别是吉姆萨和瑞氏染色后的巨噬细胞形态。图2是罗非鱼腹腔巨噬细胞体外培养不同时间的增殖曲线图。图3是永生化罗非鱼巨噬细胞不同传代稳定性显微镜照片，其中P3、P5、P10、P20和P30分别代表第3、5、10、20和30代。图4和图5是EBV病毒感染罗非鱼腹腔巨噬细胞的PCR结果，EBV及其LAMP1基因均有阳性扩增。图6是EBV病毒感染永生化罗非鱼腹腔巨噬细胞SB杂交结果，样品2和6为阳性，其余为阴性。图7是EBV病毒感染永生化罗非鱼腹腔巨噬细胞NB杂交结果，样品2和6为阳性，其余为阴性。图8是永生化罗非鱼巨噬细胞染色体数目分布图。图9是永生化罗非鱼巨噬细胞的分子鉴定结果，其中M:标准分子量；1为阴性对照；2为永生化罗非鱼巨噬细胞。具体实施方式以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。1.1罗非鱼的饲养挑选体重为(100土5)g健康尼罗罗非鱼，于28-30℃水温条件下在充气水族箱中饲养，正常喂食7天后，对每尾罗非鱼腹腔注射250μL角鲨烯，每隔2天注射相同剂量角鲨烯，连续注射3次，并于分离细胞前一天停止喂食。1.2腹腔巨噬细胞的分离培养及体外增殖实验在注射角鲨烯后第7天，使用100mg/L的MS-222麻醉试验鱼，75％酒精消毒体表。用预冷的PBS冲洗腹腔，收集冲洗液于45ml离心管中，300g、4℃离心10min。吸去上清，细胞沉淀用HBSS重悬，300g、4℃离心10min洗涤1次。细胞重悬于2mlHBSS，加入9ml灭菌三蒸水作用20s破裂红细胞，立即加入1ml10×HBSS。300g、4℃离心10min，HBSS洗涤2次，最后用L-15培养基重悬细胞，进行适当稀释后台盼蓝染色，计算活细胞数，瑞氏染色观察细胞状态。然后分别用含100IU/ml氨苄青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、10％FBS的L-15培养基调整细胞密度约为1×106个/ml，于12孔板中28℃培养24h后吸去悬浮细胞，加入新培养基继续培养。在培养24、48和72小时后，吸去培养上清，加入瑞氏染色液染色5-10min，PBS洗涤2次，于倒置显微镜下观察细胞形态，如图1所示，细胞呈多形性，且经瑞氏和吉姆萨染色后呈典型的单核-巨噬细胞形态特征，表明所分离培养的细胞为单核/巨噬细胞。利用的MTT方法对所分离培养的细胞进行体外增殖测试，具体方法为：(1)将细胞消化后铺至96孔板中，每孔100uL已转染的细胞悬液，约5000细胞。(2)将培养板在培养箱孵育30min。(3)向每孔加入10μLMTT溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D值的读数)。(5)将培养板在培养箱内孵育1-4小时。(6)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。如图2所示，罗非鱼腹腔巨噬细胞体外培养至96小时过程中均呈指数增殖状态，至48小时后呈对数增长趋势，随着时间的推移，其增长速度逐渐放缓。1.3EBV病毒分离及永生化巨噬细胞系的建立1.3.1B958细胞培养L15培养基+10％胎牛血清+1％双抗(100U/mL青霉素、100U/mL链霉素)培养，置于28℃培养箱。B958细胞大规模培养至10-15ml后，停止加培养液(即饥饿1周左右)至培养液完全变黄，准备抽提EB病毒。1.3.2病毒抽提收集培养液，4℃、4000r/min离心30min：转移上清至另一无菌离心管。4℃、12000r/min离心120min，弃上清，加入5mL新鲜培养液反复吹打重悬，4℃、3000r/min离心20min，将上清用0.22μm一次性过滤器过滤得到EBV的浓缩液，以1mL/管无菌分装后于-70℃保存。1.3.3感染罗非鱼巨噬细胞罗非鱼巨噬细胞生长至60％面积后开始感染。感染3次，每次间隔2d.每次感染前将细胞置于4℃约1.5-3h，向每皿加入1×108个EBV，28℃孵育10h，然后换新鲜培养液。1.3.4罗非鱼巨噬细胞亚克隆及扩大培养感染3次后的罗非鱼巨噬细胞亚克隆至96孔板，挑取单克隆细胞至24孔板中于培养箱中继续培养，选取状态好的细胞扩大培养至10cm皿并于液氮容器中冻存。1.3.5永生化罗非鱼巨噬细胞的培养、传代稳定性试验及增殖测试血清：胎牛血清培养基：L15(GIBCO)培养条件：10％FBS-L151％双抗(100U/mL青霉素、100U/mL链霉素)28℃1、从液氮容器中取出细胞冻存管后，立即将细胞冻存管直接浸入37℃水浴中，在1-2分钟内摇动细胞冻存管至冻存的细胞完全融化。2、将融化完全的细胞放入水平低速离心机，600rpm/min离心5分钟。3、用75％酒精消毒细胞冻存管后，小心打开盖子，弃掉冻存液后使用1mL完全培养液重悬细胞，将细胞重悬液接种到细胞培养皿中，28℃培养箱中静置培养。4、24小时后，更换一次10％FBS-L15完全培养液，继续在培养箱中培养。5、待细胞汇合度达90％时按每孔2ml接种于24孔细胞培养板中传代培养。6、细胞用胰酶或EDTA消化，一般1传3或4即可。7、将永生化罗非鱼巨噬细胞按照以上条件培养，每3天进行一次传代，连续传代培养30代，在显微镜下观察细胞形态变化。将永生化罗非鱼巨噬细胞可在体外稳定传代至少30代(每代培养3天)，从中选取永生化巨噬细胞的2和6号样品进行试验，非永生化巨噬细胞作为对照。如图3所示，从第五代开始，永生化2号和6号出现细胞集落，至第30代可见明显细胞集落，而非永生化巨噬细胞从第5代开始细胞集落消失。8、利用的MTT方法对所获得的永生化罗非鱼巨噬细胞进行体外增殖测试：(1)将细胞消化后铺至96孔板中，每孔100uL已转染的细胞悬液，约5000细胞。(2)将培养板在培养箱孵育30min。(3)向每孔加入10μLMTT溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D值的读数)。(5)将培养板在培养箱内孵育1、3、5、7、9和11天。(6)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。1.4永生化巨噬细胞EBV感染鉴定1.4.1RNA提取将稳定传代(15代)的巨噬细胞收集至EP管中，加入1mLPBS重悬细胞，1000rpm/min，离心5min，收集细胞，弃上清；EP管中加入1mLTrizolReagent(LifeTechnologies)，裂解细胞；按照Trizol提取RNA说明书进行RNA提取。1.4.2反转录使用反转录试剂盒(PrimeScriptTMII1stStrandcDNASynthesisKit,TakaRa)对RNA进行反转录，实验操作按产品说明书进行.按下表向反应管中加入各组分：短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。扩增程序为：16℃30min，42℃30min，85℃5min。反应结束后放置-20℃冰箱保存。1.4.3RT-PCR扩增目的条带以上述反转录cDNA为模板，进行目的片段的扩增：按下表向反应管中加入各组分：短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。扩增程序为：反应结束后琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，如图4所示，EBV感染罗非鱼腹腔巨噬细胞成阳性扩增。所用引物名称及引物序列如下：1.5EBV病毒Lmp1基因整合和表达鉴定1.5.1Southernbloting(SB)1.5.1.1引物设计根据基因信息设计并合成探针引物，具体引物序列如下表所示：1.5.1.2PCR扩增探针1.5.1.2.1核酸提取罗非鱼巨噬细胞基因组DNA提取使用Qiagen公司的QIAampDNAminiKit的说明书进行，RNA提取按照Lifetechnologies公司Trizol试剂说明书进行。1.5.1.2.2核酸提取反应体系如下表所示：成分体积(μl)10×TaqEnzymebuffer5dNTP(10mM)1Primer-F(10μM)2Primer-R(10μM)2TemplateDNA1TaqEnzyme0.5Rnase-Freewater38.5共50扩增条件：94℃3min预变性；94℃10S、55℃30S、72℃30S共30个循环；最后72℃终延伸10min。反应完毕后，用1％琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果，紫外灯下切取目的片段，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，步骤按回收试剂盒说明书进行。如图5所示，EBV病毒Lmp1基因呈阳性扩增。1.5.1.2.3SB实验步骤1.5.1.2.3.1根据需要寻找合适的酶切位点对DNA进行酶切选择内切酶EcoRI作为酶切位点酶切体系如下：1.5.1.2.3.2酶切后处理37℃酶切过夜后，将酶切产物用0.6倍体积冷冻异丙醇沉淀一小时，离心去上清，溶于40ulTE，0.9％的琼脂糖凝胶电泳，40v过夜。电泳结束后，将凝胶依次用如下试剂处理进行碱变性，室温下轻轻摇动确保溶液覆盖凝胶0.25MHCl15min蒸馏水摇洗5min；变性液40min蒸馏水摇洗5min；中和液15min。转膜16小时以上。1.5.1.2.3.3杂交NC膜浸入2×SSC中5min，在杂交瓶中加入杂交液。放入42℃杂交炉中，使杂交体系升到42℃。取经超声粉碎的DNA，100℃加热变性5min，迅速加到杂交瓶中，使其浓度达到100μg/ml。继续杂交4hr。倒出预杂交的杂交液，换入等量新的已升温至42℃的杂交液，同样加入变性的DNA。将探针100℃加热5min，使其变性，迅速加到杂交瓶中。42℃杂交过夜。取出NC膜，在2×SSC溶液中漂洗5min，然后按照下列条件洗膜：2×SSC/0.1％SDS，42℃，10min；1×SSC/0.1％SDS，42℃，10min；0.5×SSC/0.1％SDS，42℃，10min；0.2×SSC/0.1％SDS，56℃，10min；0.1×SSC/0.1％SDS，56℃，10min。在洗膜的过程中，不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。实践证明，当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时终止洗膜。将洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水份，并用保鲜膜包裹，将膜正面向上，放入暗盒中(加双侧增感屏)，在暗室的红光下，每一片都用透明胶带固定，合上暗盒，置-70℃低温冰箱中曝光3天时间，从中选取1-6号样品进行试验如图6所示，样品2和6为阳性，其余为阴性。1.5.2NB实验方法和步骤1.5.2.1提取RNA将稳定传代(15代)的巨噬细胞收集至EP管中，加入1mLPBS重悬细胞，1000rpm/min，离心5min，收集细胞，弃上清；EP管中加入1mLTrizolReagent(LifeTechnologies)，裂解细胞；按照Trizol提取RNA说明书进行RNA提取。1.5.2.2试剂准备(a)1.2％琼脂糖甲醛变性胶的配制：(b)上样前RNA样品的处理:Samplebuffermix体积:25.5μl10×MOPS5μl37％甲醇8μl去离子甲酰胺12.5μl将Samplebuffermix与RNA样品等体积混匀，65℃，变性5min，置于冰上5min，加入上样缓冲液，混匀后即可上样。1.5.2.3RNA电泳：所用缓冲液为1×MOPS，120V约3h。1.5.2.4转膜：上行毛细管转移法。1.5.2.5染色1.5.2.6探针标记:(Amersham公司随机引物标记试剂盒，RediprimeTMIIRandomPrimerLabellingSystem)。见说明。探针序列221bp，针对Lamp基因：GAGGGAGTCATCGTGGTGGTGTTCATCACTGTGTCGTTGTCCATGGTAATACATCCAGATTAAAATCGCCAGAAACAGGAGGAGCCAAAGGAGATCAACCAATAGAGTCCACCAGTTTTGTTGTAGATAGAGAGCAATAATGAGCAGGATGAGGTCTAGGAAGAAGGCTAGGAAGAAGGCCAAAAGCTGCCAGATGGTGGCACCAAGTCGCCAGAGCATCTActin探针序列为：aagagaggtatcctgaccctcaaataccccattgagcacggtattgtgaccaactgggatgacatggagaagatctggcatcacaccttctacaatgagctccgtgttgcccctgaggagcaccctgtcgtgctcactgaggctcccctgaatcccaaagccaacagagagaagatgacacagatcatgttcgagacct1.5.2.7杂交杂交缓冲液的配制(a)预杂交：将杂交缓冲液倒入杂交管中65℃预热15min后放入交联固定的膜65℃预杂1～2h；(b)杂交：将标记好的探针放入杂交管中，65℃杂交过夜；(c)洗膜：用洗膜缓冲液2×SSC/0.2％SDS，在65℃/15min条件下洗膜2～3次；(d)压片：将洗好的膜从杂交管中拿出，转移至两层塑膜中，检测杂交信号强弱，将膜放入磷屏中，根据信号强弱压数小时或过夜；(e)检测杂交信号：扫描磷屏。从中选取1-6号样品进行试验如图7所示，永生化样品2号和6号为阳性，其余为阴性。1.6TRAP法(Telomeraserepeatamplificationprotocol)检测端粒酶活性1)细胞培养将永生化的巨噬细胞铺至六孔板中(以未染毒的细胞作为对照)，待细胞长至密度约80％时收集细胞，离心后用PBS洗细胞一次；2)RNA提取细胞用细胞裂解液裂解，利用TRIZOL进行RNA提取；3)PCR反应体系：无菌水将体积补齐至10微升，混合均匀后，30℃反应30min，94℃灭活10min；4)RealTime-PCR体系：端粒酶引物：Forwardprimer序列:5’-ATTCCTTCGGACAGCGTAA-3’Reversedprimer序列:5’-GAGGACTTACTCTTACACTTCGCTCACC-3’5)步反应体系：混匀以后，94℃10min；94℃30s、60℃90s40个循环进行RealTime-PCR，60℃90s收集信号。6)端粒酶活性检测结果发现不同的染毒克隆细胞株端粒酶活性均发生不同程度增加，表明EBV感染导致端粒酶活性增加，永生化细胞成功构建。1.7永生化罗非鱼巨噬细胞的核型分析1.7.1材料已获得的永生化罗非鱼巨噬细胞1.7.2方法有丝分裂中期染色体制备：无菌条件下取永生化罗非鱼巨噬细胞，加入含20％胎牛血清和PHA(phytohemagglutinin，植物血球凝结素)的培养液，28℃培养4d，加秋水仙素碱至终浓度0.08ug/ml，继续培养2h。用75mmol/LKCI低渗处理细胞30min，然后固定液(甲醇：冰醋酸-3：1)漂洗4次，制成染色体中期分裂相的玻片。染色体玻片用Giemsa染色0.5h。然后在显微镜下观察和照相，选取1分散良好染色体清晰的中期分裂相进行计数，再分别选择20个染色体形态最清晰的中期分裂相拍照、放大并剪下每个染色体，然后进行染色体测量，分类及核型分析。1.7.3结果分析发现永生化罗非鱼巨噬细胞染色体数目为44的占58.6％，表明该细胞染色体数目应为44.核型分析后发现其核型公式如图8所示。1.8永生化罗非鱼巨噬细胞的致癌性评估1).取四株永生化罗非鱼巨噬细胞，培养至对数期；2).将细胞消化后离心收集细胞，PBS洗细胞一次；3).将细胞用100微升PBS重悬后注射裸鼠背部皮下，每株细胞注射5只裸鼠(1*106个细胞)，并设立空白对照；4).注射后3-4周观察成瘤情况。结果表明，对所选择的6号克隆细胞进行裸鼠致癌性评估后发现，这株永生化罗非鱼巨噬细胞不具有致癌性。1.9永生化罗非鱼巨噬细胞的分子鉴定RNA提取、反转录、RT-PCR、电泳等试验方法见1.4部分。所使用的罗非鱼18S特异性引物如下：引物名称序列(5’--3’)Tila18S-1FCGCCGAGAAGACGATCAAACTila18S-1RTTCATTGATGCACGAGCCGAProduct624bp如图9所示，用罗非鱼特异性18S扩增引物进行PCR扩增后获得特异性目的条带，表明所鉴定的细胞来自于罗非鱼机体。将此PCR产物进行测序，并在NCBI数据库进行BLAST比对，结果表明所获得的序列为罗非鱼18S序列，表明所获得的永生化细胞是罗非鱼据巨噬细胞细胞。18S测序结果：CAAGTANGTACAGTCGTACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGGCTACACCGAGCGGCCCGCCTGCGGCGCACCCGGTGTTCTCCCTCTTTGCCGCCGAGGGTCTCCCGCCACCGTCACCGGTGCGGGTCTCCCGAGGTTGTCGGCTCGCGCGTCCCCCACCGGAGCTCGAGCCTTAGTCTGGGCCTGGTCACCGGCCGGACGACCCGACGGCCCCGCCCCGCCTCTACGCCAAAGCGAGCCCGCTGCCCCGACCGGCTCCTCCGAGGGCCGACGGAGGAGAGTCGGGACTGCGGCTCGTTGGAGGCGGGCGCCGGGGTCCCCGTCCGGCAACCACCGGTCCCGGCCCGCCACGAGAACCTCAACCGAAAGCGCGGGCTGGCGGTTTCGCCCTGACCGCTGCCCGCGCGCCTCCGGGTACCCAACTCTCCTCCCTCCTGCGGAGGGAGCACGGGGGGTTCAATGTCTCCTCTCCCCTGCCCCGGCGGAGGAAGGAGCGCCCGGGGGTTTTTTCCCTTCCTTTAAACCCCTTATCCCGTCTACGAATGTGGCAACCCACGGTAAAACAAAAAAACAATACGACTCTTAGCGGTGGATCACTCGGCTGGGG。当前第1页1 2 3