本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种用于免疫细胞体外培养的培养基及其制备方法。
背景技术：
研究表明，免疫细胞在应急状态下急速扩增是免疫应答对环境变化的所做的应答，从而起到吞噬、杀死并清除异源物质的作用。然而对于癌变组织，肿瘤细胞可以具有免疫逃逸的特点，即可以躲过正常的免疫防御系统，进而在体内过度增长形成肿瘤组织。随着免疫细胞个性化技术的兴起，目前认为体外快速扩增天然形式免疫细胞或遗传修饰的免疫细胞后再回输到哺乳生物体内，有利于提高机体的免疫防御能力，表现在可以提高机体抗肿瘤等疾病治疗能力、使组织器官年轻化以及延长机体寿命的能力。
中国专利申请CN105936891A公开了一种用于免疫细胞体外培养的培养基，包括无血清基础培养基、血浆、细胞因子和苁蓉总苷。所述苁蓉总苷的含量为5-15mg/mL，所述血浆和无血清基础培养基的体积比为1：15-1：25，所述细胞因子包括白细胞介素、单克隆抗体和干扰素，所述白细胞介素为白介素-2、白介素-4、白介素-5、白介素-12、白介素-15、白介素-23中的一种或多种，所述单克隆抗体为抗CD3抗体、抗CD28抗体中的一种或多种，所述干扰素为γ-干扰素。
中国专利申请CN105176925A公开了一种免疫细胞无血清培养基及其制备和用途，该发明的无血清培养基的主要成分为：地塞米松、人转铁蛋白、胰岛素、胆固醇、过氧化氢酶、亚硒酸钠和二巯基乙醇。
目前，虽然已经研发出免疫细胞无血清培养基，但是存在价格昂贵，培养免疫细胞时其增长速度慢等问题。因此，研发出一种价格较低、适合免疫细胞快速增殖的用于免疫细胞体外培养的培养基是必要的。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于免疫细胞体外培养的培养基及其制备方法。本发明用于免疫细胞体外培养的培养基成分明确且价格较低，能提供细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境，能够显著提高免疫细胞的扩增速度，使免疫细胞体外培养的时间明显缩短。
本发明的技术方案是：
一种用于免疫细胞体外培养的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：明胶30-42mg/L，D-泛酸钙8-12μM，丝胶蛋白30-40mg/L，亚硒酸钠40-60μM，成纤细胞生长因子7-15μg/L，胰高血糖素2-5mg/L，还原型谷胱甘肽2-4μg/L，叶酸1.5-2.5mg/L，硫辛酸0.02-0.08mg/L，腺苷脱氨酶10-14mg/L，黄芪甲苷3-5mg/L。
一种用于免疫细胞体外培养的培养基，优选的方案是，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：明胶35mg/L，D-泛酸钙9μM，丝胶蛋白33mg/L，亚硒酸钠53μM，成纤细胞生长因子10μg/L，胰高血糖素4mg/L，还原型谷胱甘肽3μg/L，叶酸1.8mg/L，硫辛酸0.05mg/L，腺苷脱氨酶12mg/L，黄芪甲苷4mg/L。
所述基础培养基为DMEM或F12培养基。
另外，本发明还提供了所述用于免疫细胞体外培养的培养基的制备方法，步骤如下：
S1向基础培养基中加入D-泛酸钙、丝胶蛋白、亚硒酸钠、成纤细胞生长因子、胰高血糖素、还原型谷胱甘肽、叶酸、硫辛酸和黄芪甲苷，搅拌25-40分钟，加入腺苷脱氨酶，继续搅拌15-25分钟，加入明胶，搅拌1小时，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至7.0-7.5，用0.2-0.25微米滤膜过滤除菌，即得。
优选地，所述步骤S1搅拌35分钟。
优选地，所述步骤S1继续搅拌22分钟。
优选地，所述步骤S2调节步骤S1所得混合物的pH至7.3。
优选地，所述步骤S2用0.21微米滤膜过滤除菌。
本发明用于免疫细胞体外培养的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，添加在所述基础培养基中的添加剂包括明胶、D-泛酸钙、丝胶蛋白和黄芪甲苷等。本发明培养基中各成分相互协调，共同作用，提供细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境，能够显著提高免疫细胞的扩增速度，大大缩短免疫细胞培养的时间。
与现有技术相比，本发明提供的用于免疫细胞体外培养的培养基具有以下优势：
(1)本发明提供的用于免疫细胞体外培养的培养基成分明确且价格较低，能提供细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境，能够显著提高免疫细胞的扩增速度，大大缩短免疫细胞培养的时间。
(2)本发明提供的用于免疫细胞体外培养的培养基不含有胎牛血清及不含任何动物来源成份，提高了临床安全性。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明所用明胶可购自深圳安泰生物科技有限公司，DMEM培养基可购自Sigma公司，F12培养基可购自Sigma公司，黄芪甲苷可购自惠州市神农本草保健制品有限公司。
实施例1、一种用于免疫细胞体外培养的培养基
所述用于免疫细胞体外培养的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，添加剂的成分以终浓度计，包括：明胶30mg/L，D-泛酸钙8μM，丝胶蛋白30mg/L，亚硒酸钠40μM，成纤细胞生长因子7μg/L，胰高血糖素2mg/L，还原型谷胱甘肽2μg/L，叶酸1.5mg/L，硫辛酸0.02mg/L，腺苷脱氨酶10mg/L，黄芪甲苷3mg/L。
所述基础培养基为F12培养基。
制备方法：
S1向基础培养基中加入D-泛酸钙、丝胶蛋白、亚硒酸钠、成纤细胞生长因子、胰高血糖素、还原型谷胱甘肽、叶酸、硫辛酸和黄芪甲苷，搅拌25分钟，加入腺苷脱氨酶，继续搅拌15分钟，加入明胶，搅拌1小时，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至7.0，用0.2微米滤膜过滤除菌，即得。
实施例2、一种用于免疫细胞体外培养的培养基
所述用于免疫细胞体外培养的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：明胶42mg/L，D-泛酸钙12μM，丝胶蛋白40mg/L，亚硒酸钠60μM，成纤细胞生长因子15μg/L，胰高血糖素5mg/L，还原型谷胱甘肽4μg/L，叶酸2.5mg/L，硫辛酸0.08mg/L，腺苷脱氨酶14mg/L，黄芪甲苷5mg/L。
所述基础培养基为F12培养基。
制备方法：
S1向基础培养基中加入D-泛酸钙、丝胶蛋白、亚硒酸钠、成纤细胞生长因子、胰高血糖素、还原型谷胱甘肽、叶酸、硫辛酸和黄芪甲苷，搅拌40分钟，加入腺苷脱氨酶，继续搅拌25分钟，加入明胶，搅拌1小时，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至7.5，用0.25微米滤膜过滤除菌，即得。
实施例3、一种用于免疫细胞体外培养的培养基
所述用于免疫细胞体外培养的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：明胶35mg/L，D-泛酸钙9μM，丝胶蛋白33mg/L，亚硒酸钠53μM，成纤细胞生长因子10μg/L，胰高血糖素4mg/L，还原型谷胱甘肽3μg/L，叶酸1.8mg/L，硫辛酸0.05mg/L，腺苷脱氨酶12mg/L，黄芪甲苷4mg/L。
所述基础培养基为DMEM培养基。
制备方法：
S1向基础培养基中加入D-泛酸钙、丝胶蛋白、亚硒酸钠、成纤细胞生长因子、胰高血糖素、还原型谷胱甘肽、叶酸、硫辛酸和黄芪甲苷，搅拌35分钟，加入腺苷脱氨酶，继续搅拌22分钟，加入明胶，搅拌1小时，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至7.3，用0.21微米滤膜过滤除菌，即得。
对比例1、一种用于免疫细胞体外培养的培养基
所述用于免疫细胞体外培养的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：明胶35mg/L，D-泛酸钙9μM，丝胶蛋白33mg/L，亚硒酸钠53μM，成纤细胞生长因子10μg/L，胰高血糖素4mg/L，还原型谷胱甘肽3μg/L，叶酸1.8mg/L，硫辛酸0.05mg/L，腺苷脱氨酶12mg/L，连翘苷4mg/L。
所述基础培养基为DMEM培养基。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，将黄芪甲苷替换为连翘苷。
对比例2、一种用于免疫细胞体外培养的培养基
所述包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：明胶35mg/L，D-泛酸钙9μM，丝胶蛋白33mg/L，亚硒酸钠53μM，成纤细胞生长因子10μg/L，胰高血糖素4mg/L，还原型谷胱甘肽3μg/L，叶酸1.8mg/L，硫辛酸0.05mg/L，腺苷脱氨酶12mg/L，肉苁蓉总苷4mg/L。
所述基础培养基为DMEM培养基。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，将黄芪甲苷替换为肉苁蓉总苷。
试验例一、本发明所得用于免疫细胞体外培养的培养基对免疫细胞的培养效果
受试培养基：本发明实施例1-3所得用于免疫细胞体外培养的培养基，以及对比例1和对比例2所得用于免疫细胞体外培养的培养基。
试验方法：选用人来源的T细胞做体外细胞培养实验，细胞按104接种后分别加入本发明实施例1-3用于免疫细胞体外培养的培养基，对比例1和对比例2用于免疫细胞体外培养的培养基进行培养(37℃，5％CO2)，培养14天后，测定细胞数量，结果如表1所示。
表1：不同培养基对免疫细胞培养后细胞数量
由表1可以看出，在相同的培养时间内，生长在本发明实施例1-3所得用于免疫细胞体外培养的培养基中免疫细胞的细胞数量，明显大于生长在对比例1和对比例2所得用于免疫细胞体外培养的培养基中免疫细胞的细胞数量。这说明，本发明用于免疫细胞体外培养的培养基可以明显促进免疫细胞的增殖，本发明用于免疫细胞体外培养的培养基的扩增效果显著。