本发明属于细胞培养基技术领域，具体涉及一种适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基及其制备方法。
背景技术：
关节软骨主要是由软骨细胞和细胞外基质组成的无血管组织，主要依靠关节的运动和挤压吸收营养物质，所以软骨损伤后自我修复能力比较弱，其损伤后的修复移植一直以来是医学界的难题之一。近年来，随着组织工程技术的发展，自体软骨移植在软骨损伤的临床治疗在国内外都有应用。临床研究对患者组织取材有限，并且也因为软骨细胞是终末分化细胞，体外增殖能力有限且易去分化，所以对体外软骨细胞的培养和扩增成为目前要解决的关键。
中国专利申请CN104480066A公开了一种软骨细胞培养基及软骨细胞培养方法，该软骨细胞培养基包括：基础培养基、浓度为5-20％的血清、浓度为1-20ng/ml的血小板源性生长因子和浓度为(1-5)*10-5M/Lβ-巯基乙醇。中国专利申请CN104120105A公开了一种用于培养老龄人群软骨细胞的无血清培养基，包括基础培养基和添加剂，添加剂浓度成分为：233μM-287μM维生素C，3.7μM-8.9μM亚油酸，9μM-17μM胆固醇，6nM-15nM地塞米松，43μM-58μM乙酰半胱氨酸，18μg/mL-32μg/mL转铁蛋白，22nM-52nM亚硒酸钠，13μM-24μM泛酸钠，28μM-43μM生物素，7μg/mL-18μg/mL胰岛素，2ng/mL-9ng/mL表皮生长因子，2ng/mL-9ng/mL成纤维生长因子，2ng/mL-9ng/mL血小板衍生生长因子，0.5％-2.5％人血清白蛋白。
现有的适用于软骨细胞体外培养的培养基有的含有血清，因为血清是由很多大小不同生物分子组成的极为复杂的混合物，它能提供细胞在体外培养时所需要的生长因子、激素、结合蛋白，并提供保护作用；而且本身血清中还富含有丝分裂因子，也利于细胞系和原代培养。但血清培养基存在一定的弊端，无法规避动物血清中的异源体，如果使用动物血清培养基培育出来的细胞，会存在人体异源体排斥和冲突。有的培养基虽然不含血清，但是，存在价格昂贵的问题。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基及其制备方法。本发明提供的适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基不含血清，排除了动物来源的病原体污染，提高了软骨细胞扩增速度，大大缩短了软骨细胞培养的时间，本发明提供的适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基的成本较低，有利于规模化应用。
本发明的技术方案是：
一种适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：丁二胺2-3μM，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白10-20μg/mL，纤黏连蛋白15-25ng/mL，转铁蛋白25-35μg/mL，胰岛素5-10μg/mL，转化生长因子1-10ng/mL，表皮生长因子3-15ng/mL，聚赖氨酸2-5mg/mL，花生四烯酸1-3μM，亚麻酸4-10μM，血清铺展因子4-11ng/mL，维生素C15-25μg/mL，银胶菊内酯10-30μg/mL，黄酮20-32μg/mL。
一种适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基，优选的方案是，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：丁二胺2.5μM，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白16μg/mL，纤黏连蛋白20ng/mL，转铁蛋白28μg/mL，胰岛素8μg/mL，转化生长因子3ng/mL，表皮生长因子10ng/mL，聚赖氨酸4mg/mL，花生四烯酸2μM，亚麻酸6μM，血清铺展因子7ng/mL，维生素C 20μg/mL，银胶菊内酯22μg/mL，黄酮25μg/mL。
优选地，所述基础培养基为DMEM或F12培养基。
另外，本发明的还提供了所述适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基的制备方法，步骤如下：
S1向基础培养基中加入丁二胺、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、纤黏连蛋白、转铁蛋白、胰岛素、转化生长因子、表皮生长因子、聚赖氨酸、花生四烯酸、亚麻酸、血清铺展因子、维生素C、银胶菊内酯和黄酮，混合均匀，得混合物；
S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为3-8％的氢氧化钠溶液，调节培养基的pH至6.9-7.3，即得。
优选地，所述步骤S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为5％的氢氧化钠溶液。
优选地，所述步骤S2调节培养基的pH至7.2。
本发明提供的适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，添加的添加剂包括丁二胺、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、转化生长因子、聚赖氨酸等。发明人意外地发现，在适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基中加入银胶菊内酯和黄酮，这两种成分能与其他成分间相互作用，使软骨细胞扩增速度得到进一步的提高。本发明提供的适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基搭配合理，各成分间相互协调，共同作用，提高了软骨细胞扩增速度，大大缩短了软骨细胞培养的时间。
与现有技术相比，本发明提供的适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基具有以下优势：
(1)本发明提供的适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基提高了软骨细胞扩增速度，大大缩短了软骨细胞培养的时间。
(2)本发明提供的适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基不含血清，排除了动物来源的病原体污染。
(3)本发明提供的是一种无动物源性成分、成分确定的适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基，可以有效保证产品批次的质量稳定性，有利于产品标准化。
(4)本发明提供的适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基的成本较低，有利于规模化应用。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明中DMEM培养基可购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，F12培养基可购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白可购自Sigma公司，聚赖氨酸可购自郑州拜纳佛生物工程股份有限公司，黄酮可购自哈尔滨百爱科技有限公司，银胶菊内酯可购自Sigma公司。
实施例1、一种适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基
所述适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：丁二胺2μM，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白10μg/mL，纤黏连蛋白15ng/mL，转铁蛋白25μg/mL，胰岛素5μg/mL，转化生长因子1ng/mL，表皮生长因子3ng/mL，聚赖氨酸2mg/mL，花生四烯酸1μM，亚麻酸4μM，血清铺展因子4ng/mL，维生素C 15μg/mL，银胶菊内酯10μg/mL，黄酮20μg/mL。
所述基础培养基为DMEM培养基。
制备方法：
S1向基础培养基中加入丁二胺、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、纤黏连蛋白、转铁蛋白、胰岛素、转化生长因子、表皮生长因子、聚赖氨酸、花生四烯酸、亚麻酸、血清铺展因子、维生素C、银胶菊内酯和黄酮，混合均匀，得混合物；
S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为3％的氢氧化钠溶液，调节培养基的pH至6.9，即得。
实施例2、一种适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基
所述适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：丁二胺3μM，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白20μg/mL，纤黏连蛋白25ng/mL，转铁蛋白35μg/mL，胰岛素10μg/mL，转化生长因子10ng/mL，表皮生长因子15ng/mL，聚赖氨酸5mg/mL，花生四烯酸3μM，亚麻酸10μM，血清铺展因子11ng/mL，维生素C25μg/mL，银胶菊内酯30μg/mL，黄酮32μg/mL。
所述基础培养基为F12培养基。
制备方法：
S1向基础培养基中加入丁二胺、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、纤黏连蛋白、转铁蛋白、胰岛素、转化生长因子、表皮生长因子、聚赖氨酸、花生四烯酸、亚麻酸、血清铺展因子、维生素C、银胶菊内酯和黄酮，混合均匀，得混合物；
S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为8％的氢氧化钠溶液，调节培养基的pH至7.3，即得。
实施例3、一种适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基
所述适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：丁二胺2.5μM，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白16μg/mL，纤黏连蛋白20ng/mL，转铁蛋白28μg/mL，胰岛素8μg/mL，转化生长因子3ng/mL，表皮生长因子10ng/mL，聚赖氨酸4mg/mL，花生四烯酸2μM，亚麻酸6μM，血清铺展因子7ng/mL，维生素C 20μg/mL，银胶菊内酯22μg/mL，黄酮25μg/mL。
所述基础培养基为F12培养基。
制备方法：
S1向基础培养基中加入丁二胺、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、纤黏连蛋白、转铁蛋白、胰岛素、转化生长因子、表皮生长因子、聚赖氨酸、花生四烯酸、亚麻酸、血清铺展因子、维生素C、银胶菊内酯和黄酮，混合均匀，得混合物；
S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为5％的氢氧化钠溶液，调节培养基的pH至7.2，即得。
对比例1、一种适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基
所述适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：丁二胺2.5μM，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白16μg/mL，纤黏连蛋白20ng/mL，转铁蛋白28μg/mL，胰岛素8μg/mL，转化生长因子3ng/mL，表皮生长因子10ng/mL，聚赖氨酸4mg/mL，花生四烯酸2μM，亚麻酸6μM，血清铺展因子7ng/mL，维生素C 20μg/mL，连翘苷元22μg/mL，黄酮25μg/mL。
所述基础培养基为F12培养基。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，将银胶菊内酯替换为连翘苷元。
对比例2、一种适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基
所述适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：丁二胺2.5μM，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白16μg/mL，纤黏连蛋白20ng/mL，转铁蛋白28μg/mL，胰岛素8μg/mL，转化生长因子3ng/mL，表皮生长因子10ng/mL，聚赖氨酸4mg/mL，花生四烯酸2μM，亚麻酸6μM，血清铺展因子7ng/mL，维生素C 20μg/mL，银胶菊内酯22μg/mL，异黄酮25μg/mL。
所述基础培养基为F12培养基。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，将黄酮替换为异黄酮。
试验例一、本发明适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基对软骨细胞生长培养效果
1、试验对象：本发明实施例1-3所得适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基，以及对比例1和对比例2所得适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基。
2、试验方法：
将获取的软骨组织切碎，然后在37℃用0.25％胰蛋白酶先消化40分钟，再用0.1％Ⅱ型胶原酶消化过夜。在1200r/min离心5分钟回收细胞，分别在本发明实施例1-3所得适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基，以及对比例1和对比例2所得适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基中重悬。在培养基中生长的细胞以5000个细胞/cm2的密度铺板。所有实验使用T75培养瓶。
细胞在达到50％到80％汇合时进行传代。在培养基中生长的细胞用PBS冲洗，收获细胞，计数并重接种。在每次传代结束时，测定细胞产率并计算群体倍增数。结果如表1和表2所示。
表1：不同培养基测得细胞产率比较
由表1可以得出，在所有检测的传代中，生长在本发明实施例1-3所得适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基中的细胞产率，明显高于生长在对比例1和对比例2所得适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基中的细胞产率。
表2：不同培养基测得生长指数比较
由表2可以得出，在所有检测的传代中，生长在本发明实施例1-3所得适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基中细胞的生长指数，明显大于生长在对比例1和对比例2所得适用于软骨细胞体外培养的无血清培养基中细胞的生长指数。