一种间充质干细胞细胞因子的制备方法和应用与流程

本发明属于间充质干细胞细胞因子技术领域，具体涉及一种间充质干细胞细胞因子的制备方法和应用。

背景技术：

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有自我更新能力的多潜能干细胞，广泛存在于多种成体组织或围产期组织中，如骨髓、脂肪、牙髓、胎盘、脐带等。间充质干细胞作为药物制剂应用于临床治疗，主要依赖其免疫调节能力和组织再生能力，但这两种能力主要归功于间充质干细胞中强大的细胞因子的分泌能力。虽然间充质干细胞具有较好的多向分化潜能，能够在特定诱导条件下分化形成脂肪、软骨、骨、神经等多种组织来源的细胞，但是，研究表明细胞因子等的分泌优势是间充质干细胞进行组织再生、修复以及疤痕修复的主要生物学机制。这些因子通过自分泌机制以调控自身的增殖、分化，通过旁分泌机制以调节邻近细胞的增殖、分化，通过内分泌机制以实现有机体整体水平的调控。

间充质干细胞能够合成并分泌多种细胞因子，如表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor，FGF)、血小板生长因子(Platelet growth factor，PDGF)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、转化生长因子(Transforming growth factor beta，TGF-β)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)、白介素6(Interleukin 6，IL-6)等。这些因子具有免疫调节、抗凋亡、促进血管生产、细胞迁移、细胞增殖等作用，是实现组织修复、组织再生必不可少的关键组成部分。

然而，普遍的观点认为组织再生、疤痕修复是由多种细胞因子协同调控实现的，并且多种细胞因子的作用效果要优于单一细胞因子的作用效果。但细胞内以及细胞所处的微环境是由多种细胞因子按照不同比例组成的，而人工方法配制而成的细胞因子组合物难以真正模拟细胞微环境所含的细胞因子种类及配比，在使用过程中会出现不良反应。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的上述不足，本发明提供一种间充质干细胞细胞因子的制备方法和应用，可有效解决现有技术中人工方法配制的细胞因子组合物无法模拟细胞微环境所含的细胞因子种类及配比，使用时出现不良反应的问题。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种间充质干细胞细胞因子的制备方法，包括以下步骤：

(1)通过组织贴壁或酶消化法提取间充质干细胞，然后对提取的间充质干细胞进行无菌检测、支原体检测、流式检测和核型等指标检测；

(2)将检测合格的间充质干细胞接种于培养容器中，加入培养基，然后置于37℃、5％CO₂条件下进行培养；其中培养基成分：体积浓度为2％的GlutaMAX^TM-I和体积浓度为10-20％的FBS，其余为DMEM；

(3)待细胞融合度达到80-90％时，将培养容器中的氧浓度调整至0.5-2％(v/v)，然后继续培养细胞过夜；

(4)将步骤(3)中培养好的细胞用0.25％胰酶-EDTA溶液消化2-3min；

(5)消化完毕后，将其置于20℃，1000-2000r/min条件下离心2-3min，然后去掉上清液，用0.9％生理盐水清洗沉淀2-3次；

(6)用0.9％生理盐水调整步骤(5)中细胞浓度至1-10×10⁷个细胞/mL，然后再加入1-3mg/mL的EDTA和5-10mg/mL的Vc，混匀；

(7)将步骤(6)所得细胞分装入冻存管中，置于气相液氮中冻存10-30min，然后放置于37℃水浴锅中复苏5-10min，再置于气相液氮中冻存10-30min，放置于37℃水浴锅中复苏5-10min，此操作反复进行3-5次；

(8)将步骤(7)所得细胞置于20℃，4000-10000r/min条件下离心5-10min，然后用0.22μm过滤器过滤，得间充质干细胞细胞因子。

进一步地，步骤(2)中所接种的间充质干细胞浓度为1-2×10⁶个细胞/cm²。

进一步地，步骤(3)培养容器中氧浓度为1％。

进一步地，步骤(6)中所添加的EDTA浓度为3mg/mL。

进一步地，步骤(6)中所添加的Vc浓度为10mg/mL。

上述制备的间充质干细胞细胞因子在制备细胞因子制剂和化妆品中的应用。

本发明提供的一种间充质干细胞细胞因子的制备方法和应用，具有以下有益效果：

(1)本发明通过简单的低氧环境诱导培养即可提高间充质干细胞因子含量，同时加入EDTA能够很好的抑制金属蛋白酶对细胞因子的降解作用，加入Vc能够很好的起到抗氧化作用，0.9％生理盐水能够有效去除细胞破碎后的核酸溶出物，因此可以大大降低细胞因子的排异反应。

(2)该制备方法简单，制备得到的间充质干细胞细胞因子制剂能够很好的模拟干细胞微环境所需的细胞因子种类和比例，在使用过程中不会出现不良反应。

附图说明

图1为间充质干细胞表面标志物检测结果图。

图2为不同冻融次数的细胞因子含量结果图。

图3为间充质干细胞细胞因子保存有效期实验结果图。

具体实施方式

实施例1间充质干细胞体外扩增及鉴定

将融合度为90％的P5代胎盘间充质干细胞消化(组织贴壁法或酶消化法)后，计数，并配制成密度为1×10⁶个细胞/mL的细胞悬液，接着用100μm细胞筛网过滤，然后分别取1mL滤液，向滤液中分别加入10μL含荧光标记的细胞表面标志物抗体，置于4℃，避光条件下孵育20min。

孵育完成后，用0.9％生理盐水(4℃)清洗一次，于1200r/min离心5min，弃上清，向沉淀中加入250μL 0.9％的生理盐水混匀，然后再加入250μL 1％的多聚甲醛固定，然后采用Beckman公司的流式细胞分析仪进行检测分析，检测结果见图1。

所使用的抗体有CD11b-FITC、CD19-ECD、CD29-FITC、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-PC7、CD73-PE、CD90-FITC、CD105-PE、HLA-DR-PC7，这些抗体均购自Beckman公司。

如图1所示，经流式检测分析发现胎盘间充质干细胞几乎不表达造血细胞表面标志如CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR；表达间充质干细胞阳性标志物如CD29、CD44、CD73、CD90、CD105。

实施例2临床级间充质干细胞细胞因子的制备

将间充质干细胞接种于培养容器中，加入培养基，然后置于37℃、5％CO₂条件下进行传代培养；其中培养基成分：体积浓度为20％的FBS和体积浓度为2％的GlutaMAX^TM-I，其余为DMEM；待P5代间充质干细胞融合度达到80-90％后，将培养容器中的氧浓度调整至1％(v/v)，然后继续培养细胞过夜；

将过夜后的细胞用0.25％胰酶-EDTA溶液消化2-3min，然后置于20℃，2000r/min条件下离心3min，去掉上清液，用0.9％生理盐水清洗沉淀2-3次后收集细胞，并检测细胞活率，对其进行细胞计数。

用0.9％生理盐水调整细胞浓度至1×10⁸个细胞/mL，然后再加入3mg/mL的EDTA和10mg/mL的Vc，混匀，接着将其转移至5mL冻存管中，放置于气相液氮中冻存10min，再置于37℃恒温水浴锅中复苏5min，最后再冻存、复苏，此操作分别反复3次、5次和10次。

将冻存、复苏后的细胞裂解液转移至50mL离心管中，于20℃，5000r/min条件下离心10min，然后用0.22μm过滤器过滤裂解液上清，最后加入0.9％生理盐水、3mg/mL的EDTA和10mg/mL的Vc，调整上清至30mL，制得间充质干细胞细胞因子。

取样抽检，检测不同冻融次数的细胞因子含量，采用ELISA方法，按照说明书对各类细胞因子(EGF、FGF、IGF-1、HGF、PDGF-AA、VEGF)进行检测，试剂盒均购自R&D公司，检测结果见图2。

由图2可知，胎盘间充质干细胞分泌较多的HGF(肝细胞因子)，分泌少量PDGF-AA(血小板生长因子AA)、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)，分泌较少IGF-1(胰岛素样生长因子)和EGF(表皮生长因子)。以3次冻融复苏为对照，P﹥0.05，说明多次反复冻融对细胞因子的提取量没有影响。

实施例3间充质干细胞细胞因子的保存有效期实验

将制备的间充质干细胞细胞因子放置于-80℃保存1个月、3个月、6个月、12个月后，以新鲜制备的间充质干细胞细胞因子为对照组，采用ELISA试剂盒，按照说明书对各类细胞因子(EGF、FGF、IGF-1、HGF、PDGF-AA、VEGF)进行检测，试剂盒均购自R&D公司，实验结果见图3。

由图3可知，以冻存3个月的细胞因子含量为参照，在冻存6个月以内细胞因子的减少量不明显(P﹥0.05)，当冻存时间增加到12个月后，细胞因子的含量有少量损失(P＜0.01)，因此干细胞因子制剂的有效期建议为12个月。

本发明制备的间充质干细胞细胞因子可用于制备间充质干细胞细胞因子制剂、化妆品等。

一种间充质干细胞因子细胞因子制剂每30mL含有如下组分：细胞因子半成品(本发明制备的间充质干细胞细胞因子)10mL、维生素C 0.1-0.2g、维生素E0.1-0.2g、生理盐水20mL，并转移至50mL细胞冻存袋中。将成品进行无菌检测、支原体检测，合格后放置于气相液氮罐(平均温度为-180℃)中保存，有效期为1年。

一种间充质干细胞因子化妆品每100mL含有如下组分：细胞因子半成品20-40mL、维生素B1 0.3-0.6g、维生素B2 0.1-0.3g、维生素C 0.3-0.6g、维生素E 0.3-0.6g、胶原蛋白5-10ml、透明质酸(相对分子量为1000000～2200000)0.1-0.5g、白蜂蜡5-10g、鲸蜡15-20g、去离子水60-80ml。