专利名称：亚铁离子诊断/测定试剂盒及亚铁离子的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种亚铁离子诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测 定亚铁离子浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
铁和总铁结合力在人体代谢过程中极为重要。铁是人体正常生理过
程中不可缺少的物质。人体含铁约3 5g，其中70%存在于红细胞血红 蛋白中；25%分布在单核巨噬细胞系统(即网状内皮系统，肝、脾、 骨髓中铁蛋白和含铁血黄素)；4. 9％分布于肌红蛋白、细胞色素、含 铁的酶；0. 1 %为循环血浆中的铁。
人体内的铁来源于食物，主要在十二指肠和小肠上部被吸收。体内 铁以铁蛋白和含铁血黄素形成贮存在骨髓、脾和肝脏内。有少量铁与 血浆转铁蛋白结合，通过血浆输送至各组织，被利用或被贮存。
血清铁的测定主要是用分光光度法，其次是原子吸收法。后者由于 灵敏度不高及基底的干扰，比分光光度法可靠性差。分光光度法应用 一类含-N-C-C:N-结构的生色原，与亚铁形成五元环，产生紫红色。 较早使用的有联吡啶和红移菲罗啉；近来多推荐灵敏度较高的亚铁嗪。 此外，尚有应用铬天青S与高铁的反应。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic
Colorimetric Method)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶) 在340nm波长处吸光度的变化，得以测定亚铁离子浓度的方法，同时， 本发明还将给出用以实现该方法的亚铁离子诊断/测定试剂盒，采用该 试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行亚 铁离子浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的 推广应用。
本发明亚铁离子浓度测定方法原理如下
烟酸+辅酶+水烟酸脱氢酶/F^ 6-羟基烟酸+还原型辅酶 这种方法应用需要亚铁离子激活的烟酸脱氢酶(nicotinate dehydrogenase; nicotinic acid hydroxylase; EC 1.17.1.5)酶促反应速率 比色法。烟酸脱氢酶酶解烟酸并同时将辅酶(在340nm处没有吸收峰) 还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型 辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的 速度，可以测算亚铁离子的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明亚铁离子诊 断/测定试剂盒较为理想
缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
烟酸 20 mmol/L
烟酸脱氢酶 12000 U/L
本发明的亚铁离子诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、烟酸、烟酸脱氢酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂
试剂l
缓冲液、稳定剂、辅酶、烟酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、烟酸脱氢酶。
辅酶、烟酸、烟酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试 剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体 试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂
试剂l
缓冲液、稳定剂、辅酶。
试剂2
缓冲液、烟酸。
试剂3
缓冲液、稳定剂、烟酸脱氢酶。
辅酶、烟酸、烟酸脱氢酶在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以 不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配 制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定亚铁离子浓度的方法，其
辅酶可以是NADP+ 、 NAD+或thio- NAD+中的 一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的亚铁离子诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
辅酶 3 mmol/L
烟酸 20 mmol/L
烟酸脱氢酶 12000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂； 使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37。C,反应时间10分钟，起始 吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测亚铁离 子样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延 迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出亚铁离 子的浓度大小。
实施例二
本实施例的亚铁离子诊断/测定试剂为双试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液100 mmol/L 稳定剂50 mmol/L
辅酶3 mmol/L
烟酸 30 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液100mmol/L
稳定剂50 mmol/L
烟酸脱氢酶10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37。C,反应时间10分钟，起始 吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测亚铁离 子样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5,反应方向为正反应(上 升反应)，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出亚铁离 子的浓度大小。
实施例三
本实施例的亚铁离子诊断/测定试剂为三试剂，包括
试剂1
(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
100mmol/L
稳定剂
50 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
烟酸 12 mmol/L
试剂3
(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50 mmol/L
烟酸脱氢酶 24000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定亚铁离子浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C， 反应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波 长405nm，被测亚铁离子样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为 4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约l分钟左右， 检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出亚铁离 子的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原 型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实 施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，釆用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分 析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.一种酶比色法的亚铁离子的浓度测定方法，其方法原理如下烟酸+辅酶+水 烟酸脱氢酶/Fe2+ 6-羟基烟酶+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出亚铁离子的浓度大小测定结果。
2. —种亚铁离子诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20~~500 mmol/L稳定剂50 mmol/L辅酶1-6 mmol/L烟酸1-50 mmol/L烟酸脱氢酶1000-80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述亚铁离子诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、烟酸、烟酸脱氢酶组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述亚铁离子诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、烟酸、烟酸脱氢酶组成双剂试剂；试剂 1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、烟酸组成；试剂2，由缓冲液、稳 定剂、烟酸脱氢酶组成。辅酶、烟酸、烟酸脱氢酶在试剂1或试剂 2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述亚铁离子诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、烟酸、烟酸脱氢酶组成多剂试剂；试剂 1，由缓冲液、稳定剂、辅酶组成；试剂2，由缓冲液、烟酸组成； 试剂3，由缓冲液、稳定剂、烟酸脱氢酶组成。辅酶、烟酸、烟酸 脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。 6.根据权利要求2所述亚铁离子诊断/测定试剂盒，其特征在于还 包括稳定剂1—4000mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为 硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法技术的亚铁离子诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定亚铁离子浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、烟酸、烟酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出亚铁离子的浓度大小。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。
文档编号G01N33/90GK101173951SQ20061009730
公开日2008年5月7日 申请日期2006年10月30日 优先权日2006年10月30日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司