专利名称：亚铁离子诊断/测定试剂盒及亚铁离子浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种亚铁离子诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定 亚铁离子浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
技术背景铁和总铁结合力在人体代谢过程中极为重要。铁是人体正常生理过程中不可缺少的物质。人体含铁约3~5g，其中70%存在于红细胞血红 蛋白中；25%分布在单核巨噬细胞系统(即网状内皮系统，肝、脾、骨 髓中铁蛋白和含铁血黄素)；4. 9%分布于肌红蛋白、细胞色素、含铁 的酶；0. 1 %为循环血浆中的铁。人体内的铁来源于食物，主要在十二指肠和小肠上部被吸收。体内 铁以铁蛋白和含铁血黄素形成贮存在骨髓、脾和肝脏内。有少量铁与血 浆转铁蛋白结合，通过血浆输送至各组织，被利用或被贮存。血清铁的测定主要是用分光光度法，其次是原子吸收法。后者由于 灵敏度不高及基底的干扰，比分光光度法可靠性差。分光光度法应用一 类含-N《-C-N-结构的生色原，与亚铁形成五元环，产生紫红色。较早 使用的有联吡啶和红移菲罗啉；近来多推荐灵敏度较高的亚铁嗪。此外， 尚有应用铬天青S与高铁的反应。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定亚铁离子浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的亚铁离子诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行亚铁离子浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。本发明亚铁离子浓度测定方法原理如下-顺乌头酸+水 乌头酸酶 柠檬酸柠檬酸+辅酶A 柠檬酸合成酶乙酰辅酶A+草酰乙酸+水 乙酰辅酶八+ 二氧化碳+还原型辅酶丙酮酸脱氢酶丙酮酸+辅酶A+辅酶这种方法应用需要亚铁离子激活的乌头酸酶(aconitase ; EC4.2丄3) 酶(偶)联柠檬酸合成酶(citrate synthase ; EC 2.3.3.1 & EC 23.3.3)、丙 酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase ; EC 1.2.1.51)酶促反应速率比色 法。乌头酸酶在亚铁离子激活下酶解顺乌头酸产生柠檬酸，再通过(偶) 联合柠檬酸合成酶、丙酮酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm 处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定 还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸 光度下降的程度/速度，可以测算亚铁离子的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明亚铁离子诊断 /测定试剂盒较为理想缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/还原型辅酶 0.25 mmol/L顺乌头酸 10mmol/L 辅酶A 5 mmol/L二氧化碳 30 mmol/L乌头酸酶 6000 U/L拧檬酸合成酶 12000 U/L丙酮酸脱氢酶 18000 U/L本发明的亚铁离子诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括-缓冲液、稳定剂、顺乌头酸、辅酶A、 二氧化碳、还原型辅酶、 乌头酸酶、柠檬酸合成酶、丙酮酸脱氢酶。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂.-试剂1缓冲液、稳定剂、顺乌头酸、辅酶A、 二氧化碳、还原型辅 试剂2缓冲液、稳定剂、乌头酸酶、柠檬酸合成酶、丙酮酸脱氢酶。 顺乌头酸、辅酶A、 二氧化碳、还原型辅酶、乌头酸酶、柠檬酸合 成酶、丙酮酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以 是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接 使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、顺乌头酸、辅酶A、 二氧化 碳、还原型辅酶。 试剂2缓冲液、稳定剂、柠檬酸合成酶、丙酮酸脱氢酶。试剂3缓冲液、稳定剂、乌头酸酶。顺乌头酸、辅酶A、 二氧化碳、还原型辅酶、乌头酸酶、拧檬酸合 成酶、丙酮酸脱氢酶在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试 剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试 剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定亚铁离子浓度的方法，其 还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一本实施例的亚铁离子诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 还原型辅酶 顺乌头酸500 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L辅酶A 5 mmol/L二氧化碳 30 mmol/L乌头酸酶 6000 U/L柠檬酸合成酶 12000 U/L丙酮酸脱氢酶 18000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成千粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8士0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测亚铁离子样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间3分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出亚铁离子的浓度大小。实施例二本实施例的亚铁离子诊断/测定试剂为双试剂，包括-试剂1三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 还原型辅酶 顺乌头酸 辅酶A 二氧化碳100mmol/L 0.25 mmol/L10 mmol/L 5 mmol/L30 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲垸-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L乌头酸酶6000 U/L柠檬酸合成酶 12000 U/L丙酮酸脱氢酶 18000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37X:，反应时间10分钟，起始吸 光度1.8士0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测亚铁离子 样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5,反应方向为负反应(下降 反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间3分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出亚铁离子 的浓度大小。 实施例三本实施例的亚铁离子诊断/测定试剂为三试剂，包括试剂l三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶顺乌头酸辅酶A画mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 5 mmol/L二氧化碳 试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂柠檬酸合成酶 丙酮酸脱氢酶试剂3三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂30 mmol/L画mmol/L500腿ol/L12000U/L18000U/L100 mmol/L500 mmol/L6000 U/L:试剂，可以直接使用乌头酸酶试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体测定亚铁离子浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反 应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340mn，测试副波长 405nm，被测亚铁离子样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为 4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约2分钟左右， 检测时间3分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出亚铁离子 的浓度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型 色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例 类同，不另一一例举。10总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分 析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的亚铁离子浓度测定方法，其方法原理如下顺乌头酸+水乌头酸酶柠檬酸柠檬酸+辅酶A柠檬酸合成酶乙酰辅酶A+草酰乙酸+水乙酰辅酶A+二氧化碳+还原型辅酶丙酮酸脱氢酶丙酮酸+辅酶A+辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出亚铁离子的浓度大小测定结果。
2. —种亚铁离子诊断/测定试剂盒，主要成分包括-缓冲液 20-500 mmol/L稳定剂 l一 4000 mmol/L还原型辅酶 0.1——0.35 mmol/L顺乌头酸 1——50mmol/L辅酶A 1——10mmol/L二氧化碳 1——50mmol/L乌头酸酶 1000——80000 U/L柠檬酸合成酶 1000——80000 U/L丙酮酸脱氢酶 1000——80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述亚铁离子诊断/测定试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、顺乌头酸、辅酶A、 二氧化碳、还原型辅酶、乌头酸酶、柠檬酸合成酶、丙酮酸脱氢酶组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述亚铁离子诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、顺乌头酸、辅酶A、 二氧化碳、还原型辅酶、 乌头酸酶、拧檬酸合成酶、丙酮酸脱氢酶组成双剂试剂；试剂l，由 缓冲液、稳定剂、顺乌头酸、辅酶A、 二氧化碳、还原型辅酶组成; 试剂2，由缓冲液、稳定剂、乌头酸酶、柠檬酸合成酶、丙酮酸脱氢 酶组成。还原型辅酶、顺乌头酸、辅酶A、 二氧化碳、还原型辅酶、 乌头酸酶、柠檬酸合成酶、丙酮酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位 置可以不限。
5. 根据权利要求2所述亚铁离子诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、顺乌头酸、辅酶A、 二氧化碳、 还原型辅酶、乌头酸酶、柠檬酸合成酶、丙酮酸脱氢酶组成多剂试 齐!h试剂l，由缓冲液、稳定剂、顺乌头酸、辅酶A、 二氧化碳、还 原型辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、柠檬酸合成酶、丙酮酸 脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、乌头酸酶组成。还原型辅 酶、顺乌头酸、辅酶A、 二氧化碳、还原型辅酶、乌头酸酶、柠檬 酸合成酶、丙酮酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不 限。
6. 根据权利要求2所述亚铁离子诊断/测定试剂盒，其特征在于还包 括稳定剂l"^000 mmol/L或0.1Q/。-100y。体积比。所述稳定剂为硫 酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的亚铁离子诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定亚铁离子浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、顺乌头酸、辅酶A、二氧化碳、还原型辅酶、乌头酸酶、柠檬酸合成酶、丙酮酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂混合，使之发生酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出亚铁离子的浓度大小。
文档编号G01N33/84GK101324608SQ20071002323
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司