含左归丸血清代谢物质组有效成分的左归丸血清及其制备方法与应用与流程

本发明属于中药血清药物化学技术领域，具体涉及含左归丸血清代谢物质组有效成分的左归丸血清及其制备方法与应用。

背景技术：

以中药口服给药后血清为样品，按传统药物化学相同的研究方法，多种现代技术综合应用，从血清中分离、鉴定移行成分，研究血清中移行成分与传统疗效的相关性，阐明体内直接作用物质代谢及体内动态的方法称之为中药血清药物化学，在质量标准化研究、复方配伍机理的阐明、中药有效成分的确定以及中药给药方案的科学化等方面具有重要的研究意义。

目前，中药血清药物化学在单味中药方面的研究涉及茵陈蒿、当归、大黄、大青叶、补骨脂和东北红豆杉等，在中药复方方面的研究涉及六味地黄丸、黄连解毒汤、复方茵陈蒿汤、归苓片、银翘散和复方安替威胶囊等。

中药左归丸出自《景岳全书》卷五十一新方八阵方，是由熟地黄、菟丝子、牛膝、龟甲胶、鹿角胶、山药、山茱萸、枸杞子八味中药组成的复方，具有滋阴补肾的作用，用于真阴不足、腰酸膝软、盗汗遗精、神疲口燥。目前，左归丸的研究大多是质量评估、基因表达、骨髓间质细胞、卵巢细胞及左归丸复方等方面的研究。左归丸血清对体外分离、培养的成骨细胞分泌骨钙素有显著影响，对成骨细胞的骨形成有促进作用，对破骨细胞有直接的抑制作用，且可通过成骨细胞间接对破骨细胞产生抑制作用，是其防治骨质疏松症的机制之一。左归丸血清能够促使骨髓间充质干细胞骨向分化中碱性磷酸酶表达。而碱性磷酸酶是成骨细胞的一种细胞表面标志性酶，随着成骨分化程度的增加，碱性磷酸酶表达增强。左归丸血清也可明显提高骨髓间质细胞向肝细胞的转化率，对骨髓细胞向肝细胞的分化具有促进作用。说明左归丸血清代谢物质组具有多靶点作用的特点。然而，含左归丸血清代谢物质组有效成分的左归丸血清未有报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供含左归丸血清代谢物质组有效成分的左归丸血清及其制备方法与应用，该左归丸血清中高度富集了苷类有效成分，可明显提高高糖干预下受抑制的胚胎发育率，促进胚胎发育。

本发明提供的一种左归丸血清的制备方法，包括如下步骤：(1)将制备左归丸的药材按照制备左归丸的配方用量混合后进行水提，得水提液；(2)对动物给药所述水提液，给药结束后进行采血，将血液离心后收集血清，即可得到所述左归丸血清；所述给药步骤中，给药量为10～20g·kg^-1·d^-1，连续给药7～10天，每天1～2次。

本发明提供的一种左归丸血清的制备方法，包括如下步骤：取离体血液，将离体血液离心后收集血清，即可得到所述左归丸血清；所述离体血液为如下动物的离体血液：(1)将制备左归丸的药材按照制备左归丸的配方用量混合后进行水提，得水提液；(2)对动物给药所述水提液，给药结束后，即得所述动物；所述给药步骤中，给药量为10～20g·kg^-1·d^-1，连续给药7～10天，每天1～2次。

上述的制备方法中，步骤(1)中，所述药材为制备左归丸的常规药材，具体为熟地、山药(炒)、枸杞、山茱萸、川牛膝、鹿角胶、龟板胶和菟丝子，所述配方用量为制备左归丸的常规配方用量，具体为：熟地(240g)、山药(炒)(120g)、枸杞(120g)、山茱萸(120g)、川牛膝(90g)、鹿角胶(120g)，龟板胶(120g)、菟丝子(120g)。

上述的制备方法，步骤(1)中，所述水提液中的生药量可为(0.5～1)g·mL^-1，具体可为1g·mL^-1。

上述的制备方法，步骤(1)中，所述水提的步骤可如下：将水加热至提取温度(如50℃)后，放入除鹿角胶和龟板胶外的药材进行煎煮，得水提液Ⅰ；取龟板胶、鹿角胶加入水加热使其溶解，待全部溶解后与所述水提液Ⅰ混合，得水提液Ⅱ；浓缩所述水提液Ⅱ，即可得到所述水提液。

上述的制备方法，步骤(1)中，所述水提步骤中，提取温度可为50℃～沸点温度，具体可为50℃；提取时间(每次提取的时间)可为1.0～1.5h，具体可为1.5h；水的用量(每次提取时水的用量)可为1g药材：(8～10)mL水，具体可为1g药材：10mL水；水提次数可为2～3次，具体可为3次。具体步骤如下：取8倍量水加热至50℃，放入除鹿角胶和龟板胶外的药材加热煎煮1.5h；第二次取8倍量水煎煮1.5h；第三次取8倍水煎煮1.5h；分别用八层纱布过滤，合并三次浸出液，得水提液Ⅰ。

上述的制备方法，步骤(2)中，所述动物可为雌雄大鼠。

上述的制备方法，步骤(2)中，所述给药量具体可为20g·kg^-1·d^-1；给药时间具体可为连续给药7天，每天1次。

上述的制备方法，步骤(2)中，所述给药步骤中，给药方式可为灌胃。

上述的制备方法，所述采血步骤中，在倒数第二次给药完成后禁食12h，最后一次给药后开始计时，采血的时间控制在最后一次给药后的30～40min内，具体可控制在最后一次采血的30min内。采血方式可为眼眶毛细管采血或腹主动脉采血。

所述离体血液为如下动物的离体血液：在倒数第二次给药完成后禁食12h，且为最后一次给药后的30～40min内的动物，具体可控制在最后一次采血的30min内。

上述的制备方法，所述离心步骤中，离心转速可为3000～4000r·min^-1，具体可为4000r·min^-1，离心时间可为15～20min，具体可为15min。

本发明进一步提供了一种由上述的制备方法制备得到的左归丸血清，该左归丸血清中高度富集了苷类有效成分，如环烯醚萜苷活性成分。

本发明还提供了上述左归丸血清在制备具有如下1)-2)中任一项功能的药物中的应用：

1)提高高糖干预下受抑制的胚胎发育率；

2)促进胚胎发育中的应用。

本发明具有如下有益效果：

1.水加热至50℃，再放入除鹿角胶和龟板胶外的药材加热煎煮，提高了水提液中的苷类有效成分的含量；

2.实验动物给药量达10～20g·kg^-1·d^-1，高于实验动物的给药剂量，提高了左归丸血清代谢物质组有效成分的含量，实现了苷类有效成分的高度富集；

3.由本方法制得的左归丸血清代谢物质组，可明显提高高糖干预下受抑制的胚胎发育率，促进胚胎发育。

附图说明

图1为UPLC-Q-TOF/MS检测的本发明左归丸血清及空白血清的BPI图，其中，图1(A)为本发明左归丸血清样品；图1(B)为空白血清样品。

图2为基于UPLC-Q-TOF/HDMS检测的化学成分进行的多变量数据分析图，其中，图2(A)为给药组(Group 1)与空白对照组(Group 2)血清UPLC-Q/TOP-MS数据经OPLS-DA分析的得分图；图2(B)为OPLS-DA分析的S-Plot图；图2(C)为保留时间_质核比为8.31-183.0978离子的变化趋势图。

图3光镜下4.5dpc时期正常囊胚和高糖培养液培养的囊胚图，(注图中：A.空白组；B.20mmol/L葡萄糖组；C.40mmol/L葡萄糖组；D.60mmol/L葡萄糖组；E.80mmol/L葡萄糖组)。

图4光镜下1.5dpc时期正常2-细胞和高糖培养液培养的2-细胞图，(注图中：A.空白组；B.20mmol/L葡萄糖组；C.40mmol/L葡萄糖组；D.60mmol/L葡萄糖组；E.80mmol/L葡萄糖组)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

左归丸药材购于北京同仁堂山西连锁药店有限公司责任公司，熟地(河南，240g)、山药炒(河南，120g)、枸杞(宁夏，120g)、山茱萸(浙江，120g)、川牛膝酒洗蒸熟(四川，90g)、鹿角胶(120g)，龟板胶(120g)、菟丝子(内蒙古，120g)。

雌性SD大鼠购于中国食品药品检定研究院，许可证号：SCXK(京)2009-0017。

实施例1、左归丸血清样品的制备及成分分析

一、左归丸血清样品的制备

按照如下步骤制备左归丸血清样品：

1、左归丸水提液的制备

按照熟地：山药：山萸肉：枸杞子：菟丝子：鹿角胶：龟板胶：川牛膝＝8：4：4：4：4：4：4：3的质量比称取各药材。除鹿角胶和龟板胶外，将各药材混合加入水在50℃下煎煮三次，其中，第一次煎煮为取8倍量(w/v)水煎煮1.5h，第二次煎煮为取8倍量(w/v)水煎煮1.5h，第三次煎煮为取8倍水量(w/v)煎煮1.5h，合并三次浸出液过八层纱布过滤。取龟板胶、鹿角胶至烧杯中加入适量水加热使溶解，待胶类全部溶解后置于煎煮好的药液中，将左归丸水煎液放入水浴锅中浓缩至生药量为1g·mL^-1。

2、左归丸血清样品的制备

将大鼠正常饲养5d，分为左归丸给药组和空白组。次日称重并根据体重按生药材量20g·kg^-1·d^-1给药量分别给予给药组左归丸水提液，空白组蒸馏水，连续给药7d，每天1次，每日给药前称重，严格控制给药量，给药方式为灌胃。6d灌胃完成后开始禁食12h，第7天灌胃后开始计时，30min内进行采血，采血方式为腹主动脉采血。将血液在-4℃放置30min，4000r·min^-1离心15min，收集血清存放于-75℃超低温冰箱待用，即可得到左归丸血清样品。

二、左归丸血清样品成分分析

1、样品预处理

取左归丸血清样品2mL，加入磷酸40μL，震荡混匀，上样到预先以3mL甲醇、3mL水活化平衡好的SPE柱上，分别用2mL水淋洗，淋洗液弃去，再以2mL甲醇洗脱，收集洗脱液，于37℃水浴下氮气流吹干，残渣用100μL 50％甲醇复溶，超声1min，混悬震荡30s后，4℃，13000rpm离心10min，取上清液用于UPLC-Q-TOF/MS分析。

2、UPLC-Q-TOF/MS分析

Waters Acquity^TM UPLC液相色谱仪(Waters公司，美国)；Waters Synapt^TMHighDefinition MS(HDMS/MS)System质谱仪(Waters公司，美国)；SPE固相萃取柱WatersOasis HLB 3cc 60mg(Waters公司，美国)。

2.1色谱条件

色谱柱：ACQUTITY UPLC^TM HSS T₃column(100mm×2.1mm i.d.，1.8μm，WatersCorp，Milford，USA)；流速0.4mL/min；柱温40℃；流动相：A：0.1％甲酸乙腈，B：0.1％甲酸水，洗脱程序见表1，进样量均5μL。

表1左归丸入血成分分析超高效液相色谱洗脱梯度

表1中，A：0.1％甲酸乙腈；B：0.1％甲酸水

2.2质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，扫描参数：正离子模式：毛细管电压3.0kV，锥孔电压30V，提取电压3.5V，离子源温度110℃，脱溶剂气温度350℃，锥孔气流量为50L/h，脱溶剂气流量600L/h。准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽(leucine-enkephalin，[M+H]⁺＝556.2771)溶液为锁定质量溶液；负离子模式：毛细管电压2.6kV，锥孔电压30V，提取电压3.5V，离子源温度110℃，脱溶剂气温度350℃，锥孔气流量为50L/h，脱溶剂气流量600L/h。准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽(leucine-enkephalin，[M-H]^-＝554.2615)溶液为锁定质量溶液，质量扫描范围：m/z 100-1000Da。

2.3指纹图谱的采集及峰的提取

采集左归丸血清样品及空白对照血清在正负离子模式下UPLC-Q/TOF-MS色谱图，见图1。同时采集给药样品及其组方药物的UPLC-Q-TOF/MS色谱图，用于对血中移行成分进行来源归属和为结构鉴定提供物质基础的信息。

采用MarkerLynx V4.1软件(Waters公司，美国)对空白血清和左归丸血清样品的UPLC-Q/TOF-MS数据进行峰的提取。参数如下：检测时间0.1-18.0min，质量范围100-1000Da，保留时间差异范围0.2min，质量数差异范围0.05Da，噪音消除水平6，峰强度阈值100。提取的数据为包括了保留时间t_R，离子质核比m/z及峰强度的三维数据矩阵，进一步应用EZinfo 2.0插件来进行主成分分析(PCA)及正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。OPLS-DA得到S-plot，在“S”图形中，上端及下端分别代表在空白及给药组的高表达水平的离子。同时根据各离子相应的趋势图(trend plot)，由此筛选空白组为零，而给药组非零的离子作为左归丸的入血成分离子。

应用OPLS-DA多变量模式识别的方法比较给药组及空白组，以寻找给药组的入血成分。在OPLS-DA得分图中，见图2(A)，可见空白组及给药组明显的区分为两组，提示给予左归丸后，大鼠血中成分发生了明显的改变。为了寻找其差异成分，在S-plot图，如图2(B)所示，通过trend plot寻找空白组含量为零，给药组含量非零的离子，如图2(C)例举了t_R-m/z为8.31-183.0978离子的trend plot，该离子仅存在于给药组的血清中，由此可知该离子为左归丸的入血成分。

对经OPLS-DA分析挖掘的左归丸入血成分离子的精确质量进行元素组成分析，计算可能的分子式，并与左归丸及其组方药物的化学信息进行比对，初步鉴定结果见表2。

表2左归丸给予雌性大鼠后含药血清经UPLC-Q/TOF-MS分析在负离子模式检测到的入血成分信息

在负离子模式下共检测了27个入血成分，包括12个原型成分和15个代谢物。在负离子模式下，对13个入血成分进行了鉴定，其中有来源于山茱萸的獐芽菜苷、马钱苷、莫诺苷、马钱苷酸、表马钱苷酸，来源于熟地的5-羟甲基-2-糠醛葡萄糖醛酸苷、二氢5-羟甲基-2-糠醛葡萄糖醛酸苷、地黄苦苷元，来源于枸杞子的香豆酸，来源于菟丝子的山奈酚葡萄糖醛酸苷，cuscutamine。本发明左归丸血清主要富集了环烯醚萜苷活性成分，是其重要的药效物质基础。

实施例2、本发明左归丸血清对小鼠胚胎体外发育的影响

一、左归丸血清样品的制备

按照实施例1相同的步骤制备左归丸血清样品。

二、实验所用试剂与仪器

所有化学药品均购自Sigma公司(St.Louis，MO，USA)。PMSG和HCG购于宁波市激素制品有限公司，透明质酸酶，操作液，KSOM培养液，DAPI染色液，超净工作台(Nu-301-330E英国NUVNR公司)，体视显微镜(261日本Olympus公司)，荧光显微镜(BX60日本Olympus公司)，CO₂培养箱(3110美国Forma公司)。

三、实验内容与方法

1、受精卵的收集和体外培养

腹腔注射PMSG 7.5IU/只，48h后注射HCG 7.5IU/只进行超数排卵，并与性成熟同系公鼠交配，次日晨(12h后)检查阴道栓。有栓雌鼠于注射HCG 18h引颈处死，摘除输卵管壶腹部置于盛有胚胎培养液的培养皿盖中，显微镜下用注射器针头将输卵管透明膨大处撕破，将游离出来的合子团在透明质酸酶中脱除颗粒细胞，尽快用操作液清洗后在培养液洗盘中用培养液洗去操作液。分别放入正常培养液和含有高浓度葡萄糖的培养液滴中，于37℃，5％CO₂饱和湿度的CO₂培养箱中培养。合笼30h后统计2细胞数，102h后统计囊胚数。

2、实验内容

实验一：将葡萄糖浓度从20mmol/L(标准KSOM培养液含量)逐渐上调到80mmol/L，分成5组：正常组，20mmol/L葡萄糖组，40mmol/L葡萄糖组，60mmol/L葡萄糖组，80mmol/L葡萄糖组。将一次实验收集的所有1-细胞胚胎用移卵针随机分入这5组。观察不同浓度葡萄糖培养液对小鼠胚胎早期发育的影响。实验二：基于实验一，通过筛选，取40mmol/L葡萄糖作为高糖抑制胚胎发育模型。将一次实验收集的所有1-细胞胚胎用移卵针随机分入4组：正常组，高糖组(40mmol/L葡萄糖)，左归丸血清组(40mmol/L葡萄糖加5％左归丸血清)。观察左归丸血清对小鼠胚胎早期发育的影响。

3、胚胎质量评价

倒置显微镜体外动态观测小鼠胚胎早期发育情况，进行形态学观察，用囊胚率、观察葡萄糖、左归丸含药血清对小鼠胚胎体外发育的影响。

4、统计分析

数据分析用SAS8.2软件，计量资料组间比较用t检验，实验数据以均值±标准差(x±s)表示，以p<0.05为差异有统计学意义。

三、实验结果

1、胚胎囊胚形态学观察

图3所示，为光镜下4.5dpc时期正常囊胚和高糖培养液培养的囊胚图。正常培养液中囊胚率在70％以上，20mmol/L葡萄糖组与空白组相似，在形态上无明显区别；60mmol/L葡萄糖组的囊胚率显著下降(p<0.01)且囊胚腔较小；80mmol/L葡萄糖组几乎未见囊胚，胚胎从2-细胞到4-细胞不等，大多数胚胎永远停留在了2-细胞时期。

2、胚胎2-细胞形态学观察

图4为光镜下1.5dpc时期正常2-细胞和高糖培养液培养的2-细胞图。40倍光镜下无法区别各组2-细胞的形态，100倍数下发现80mmol/L组的2-细胞形态有些许改变，2-细胞率无统计学差异。

3、左归丸血清组对40mmol/L高糖负荷下小鼠胚胎发育的影响如表3所示。

表3左归丸血清代谢物质组对40mmol/L葡萄糖负荷下小鼠胚胎发育率的影响

与空白组相比，#p<0.05，##p<0.01。

本研究选用40mmol/L作为葡萄糖抑制浓度，从囊胚率来看，左归丸血清组能有效地促进胚胎发育，从而显示本发明左归丸血清能提高胚胎质量，激发胚胎发育潜能。