本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种庆大霉素C1a的制备方法。
背景技术：
庆大霉素是一种氨基糖苷类抗生素,主要用于治疗细菌感染，尤其是革兰氏阴性菌引起的感染。庆大霉素能与细菌核糖体30s亚基结合，阻断细菌蛋白质合成。
《中国人民共和国药典》2000年版规定庆大霉素C组分包括C1、C1a、C2a、C2，其中，庆大霉素C1a可作为合成抗菌药物依米替星的母体。庆大霉素C1a的分子结构式如下所示：
庆大霉素C1a是合成依替米星的母体，而硫酸依替米星是我国自行研制的一种高效、低毒、抗耐药性菌的半合成氨基糖苷类抗生素，是唯一获得国家一类新药证书的抗感染药物。本品适用于对其敏感的大肠埃希杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌、沙雷氏杆菌属、长杆菌属、不动杆菌属、变形杆菌属、流感嗜血杆菌、铜绿假单孢菌和葡萄球菌引起的各类感染。临床显示本品对以下感染较好的疗效：呼吸道感染：如急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作、社区肺部感染等。肾脏和泌尿生殖系统感染：如急性肾盂肾炎、膀胱性肾盂肾炎或慢性膀胱炎急性发作等。皮肤软组织感染包括疖、痈、急性蜂窝组织炎等。创伤、手术前后感染治疗或预防性用药。而且有较低的耳、肾毒性不良反应发生率，证明了硫酸依替米星是临床应用中高效、安全的新一代半合成氨基糖苷类抗生素。
庆大霉素C1a常规的制备方法是通过小诺霉素的发酵液中分离得到。该制备方法存在诸多技术劣势，例如，生产工艺较长，生产工艺复杂，树脂吸附后需要使用混合溶剂经过三次洗脱、解析后才能得到庆大霉素C1a。同时，混合洗脱剂和解析剂中的乙醇采用蒸馏塔回收，因此导致生产设备比较昂贵，且需要消耗大量的蒸汽，从而导致生产成本较高。
有鉴于此，有必要对现有技术中的庆大霉素C1a的制备方法予以改进，以解决上述问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于公开一种庆大霉素C1a的制备方法，用以克服现有技术中的制备方法所存在的生产成本较高，操作繁琐等缺陷。
为实现上述发明目的，本发明提供了一种庆大霉素C1a的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)、将庆大霉素B产生菌进行微波诱变，然后利用化学诱变剂进行化学诱变得到庆大霉素C1a产生菌；
步骤(2)、挑选稳定且相对高产的庆大霉素C1a产生菌，在35～40℃下斜面培养8～15天；
步骤(3)、挑选成熟的菌种斜面接种于种子培养基，在35～40℃，200～250rpm下在摇床上培养40～60h；然后，接种于一级种子罐中的一级种子培养基上，30～40℃下培养40～60h；然后，接种于二级种子罐中的二级种子培养基上，30～40℃下培养20～30h；
步骤(4)、接种于发酵罐内的发酵培养基上，在30～40℃下，发酵进行至110～160h，放罐，得发酵液；
步骤(5)、对步骤(4)得到的发酵液使用微滤膜去除菌丝体及发酵液残基；微滤透过液经过超滤膜去除蛋白质、色素和多糖；将收集的超滤透过液经过纳滤膜进行常温脱盐、富集，脱盐液经浓缩、干燥制得庆大霉素C1a粗品。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(1)中的微波诱变具体为：吸取2mL孢子液悬于EP管中，将EP管放于冰浴烧杯中，在微波炉中以700W、2450MHz处理10～60s，然后在20～38℃下恒温培养箱中进行6～8h；所述化学诱变剂为浓度为0.4～1.0mg/mL的亚硝基胍。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(2)中的斜面培养基的组成为：玉米淀粉1.8～2.2g/L，KNO30.05～0.15g/L，NaCl0.04～0.06g/L，MgSO40.03～0.07g/L，K2HPO40.02～0.04g/L，小麦粉1.8～2.2g/L，碳酸钙0.09～0.11g/L，琼脂1.7～2.3g/L，余量为水。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(3)中的摇瓶培养基的组成为：淀粉1.8～2.2g/L，黄豆饼粉1.8～2.2g/L，葡萄糖0.4～0.6g/L，玉米粉0.3～0.7g/L，蛋白胨0.1～0.3g/L，KNO30.04～0.06g/L，K2HPO40.01～0.03g/L，碳酸钙0.3～0.5g/L，余量为水。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(3)中，摇瓶培养基的接种量为10～15％；
所述一级种子培养基的组成为：淀粉0.8～1.2g/L，黄豆饼粉1.4～1.6g/L，玉米粉0.8～1.2g/L，KNO30.04～0.06g/L，蛋白胨0.1～0.3g/L，泡敌0.03～0.05g/L，碳酸钙0.3～0.5g/L，余量为水，一级种子培养基的pH为8.0～8.4；
所述二级种子培养基的组成为：淀粉1.8～2.2g/L，黄豆饼粉1.4～1.6g/L，玉米粉0.4～0.6g/L，葡萄糖0.4～0.6g/L，蛋白胨0.1～0.3g/L，KNO30.05～0.15g/L，泡敌0.03～0.05g/L，余量为水，二级种子培养基的pH为8.0～8.4。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(3)中的发酵培养基的组成为：淀粉3.8～4.2g/L，黄豆饼粉3.3～3.7g/L，葡萄糖0.4～0.6g/L，玉米粉1.4～1.6g/L，蛋白胨0.1～0.3g/L，KNO30.05～0.15g/L，(NH4)2SO40.04～0.06g/L，泡敌0.03～0.05g/L，碳酸钙0.3～0.5g/L，余量为水，发酵培养基的pH为5.0～5.4。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(5)中使用微滤膜去除菌丝体及发酵液残基的操作压力为1.0～3.0bar；所述步骤(5)中使用超滤膜去除蛋白质、色素和多糖的操作压力为1.0～6bar；所述步骤(5)中使用纳滤膜进行常温脱盐、富集的操作压力为6.0～10bar。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(5)中的微滤膜选用截留分子量为20000～500000的分离膜；所述步骤(5)中的超滤膜选用截留分子量为5000～20000的分离膜；所述步骤(5)中的纳滤膜选用截留分子量为200～800的分离膜。
作为本发明的进一步改进，所述微滤膜采用的膜材料为陶瓷或者金属；超滤膜采用的膜材料为聚乙烯、聚偏氟乙烯或者聚氯乙烯；所述纳滤膜采用的膜材料为聚乙烯醇、磺化聚砜膜或者醋酸纤维素。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：在本发明中，通过对庆大霉素B产生菌进行微波诱变和化学诱变，选出一个庆大霉素C1a为主要组份的新菌株，先进行微波诱变，再进行化学诱变，从而得到庆大霉素C1a的产生菌，并进行发酵培养，得到的发酵液通过微滤膜、超滤膜、纳滤膜进行分离得到庆大霉素C1a的粗品，本发明所得到的庆大霉素C1a产生菌通过连续传代，庆大霉素C1a产量非常稳定，且具有生产成本较低等优点，非常适合于产业化应用。
具体实施方式
下面结合各实施方式对本发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
除非说明书中有特殊说明，本发明中的各个实施例中的组分、原料均采用分析纯级别。另外，各实施例中的“g”为重量单位“克”；“h”为时间单位“小时”；“ml”为体积单位“毫升”；“室温”为23℃；“接种量”为“移入培养基的体积和接种后培养液体积的比例”；“s”为时间单位“秒”；“mg”为重量单位“毫克”；“rpm”为摇瓶培养的转速单位“转/分钟”；“bar”为压力单位“巴”，1bar＝0.1兆帕(Mpa)。
实施例一：
该庆大霉素C1a的制备方法包括以下步骤。
步骤(1)、将庆大霉素B(棘孢小单孢菌的突变体)产生菌进行微波诱变，吸取2mL孢子液悬于EP管中，将EP管放于冰浴烧杯中，在微波炉中以700W、2450MHz处理10s；然后利用化学诱变剂进行化学诱变，化学诱变剂为亚硝基胍，诱变剂使用浓度为0.4mg/mL，在20℃下，恒温培养箱中进行6h的恒温培养。筛选得到庆大霉素C1a产生菌。
步骤(2)、挑选稳定且相对高产的庆大霉素C1a产生菌，在斜面培养基中进行斜面培养。该斜面培养基中的组分为(单位：g/L)：玉米淀粉1.8，KNO30.05，NaCl0.04，MgSO40.03，K2HPO40.02，小麦粉1.8，碳酸钙0.09，琼脂1.7，余量为水。该斜面培养基的pH自然(pH7±0.2)。35℃下，培养8天。
步骤(3)、挑选成熟的菌种斜面接种于摇瓶培养基，接种量为10％，在摇床上进行培养。摇瓶培养基中的组分为(单位：g/L)：淀粉1.8，黄豆饼粉1.8，葡萄糖0.4，玉米粉0.3，蛋白胨0.1，KNO30.04，K2HPO40.01，碳酸钙0.3，余量为水。该摇瓶培养基的pH自然(pH7±0.2)。摇瓶在35℃，200rpm下，培养40h。然后，接种于一级种子罐中的一级种子培养基上继续培养，接种量为10％。
该一级种子培养基中的组分为(单位：g/L)：淀粉0.8，黄豆饼粉1.4，玉米粉0.8，KNO30.04，蛋白胨0.1，泡敌0.03，碳酸钙0.3，余量为水。一级种子培养基的pH为8.0。在30℃下，罐压为0.03Mpa，培养40h，移种于二级种子罐中的二级种子培养基中继续培养。
该二级种子培养基中的组分为(单位：g/L)：淀粉1.8，黄豆饼粉1.4，玉米粉0.4，葡萄糖0.4，蛋白胨0.1，KNO30.05，泡敌0.03，余量为水。该二级种子培养基的pH为8.0。接种量为10％，在30℃下，罐压为0.1Mpa，培养20h。
步骤(4)、接种于发酵罐内的发酵培养基中发酵，接种量为10％。该发酵培养基中的组分为(单位：g/L)：淀粉3.8，黄豆饼粉3.3，葡萄糖0.4，玉米粉1.4，蛋白胨0.1，KNO30.05，(NH4)2SO40.04，泡敌0.035，碳酸钙0.3，余量为水。该发酵培养基的pH为5.0，发酵在30℃下进行，发酵进行至110h放罐。
(5)对步骤(4)得到的发酵液使用微滤膜去除菌丝体及发酵液残基，在1.0bar的操作压力下，微滤膜选用截留分子量为20000的陶瓷膜，收集微滤膜透过液。
将微滤膜透过液经过超滤膜，在1.0bar操作压力条件下去除蛋白质、色素和多糖等大分子杂质，超滤膜选用截留分子量为5000的聚偏氟乙烯膜，收集超滤膜透过液。
将超滤膜透过液在6.0bar操作压力条件下经过截留分子量为200的醋酸纤维素膜(一种纳滤膜)进行常温脱盐、富集，脱盐液经浓缩、干燥制得含量60％的固态庆大霉素C1a粗品。
实施例二：
该庆大霉素C1a的制备方法包括以下步骤。
步骤(1)、将庆大霉素B产生菌进行微波诱变，吸取2mL孢子液悬于EP管中，将EP管放于冰浴烧杯中，在微波炉中以700W、2450MHz处理30s；然后利用化学诱变剂进行化学诱变，化学诱变剂为亚硝基胍，诱变剂使用浓度为0.7mg/mL，在30℃下恒温培养箱中进行7h的恒温培养。筛选得到庆大霉素C1a产生菌。
步骤(2)、挑选稳定且相对高产的庆大霉素C1a产生菌，进行斜面培养。斜面培养基中的组分为(单位：g/L)：玉米淀粉2.0，KNO30.1，NaCl0.05，MgSO40.05，K2HPO40.03，小麦粉2.0，碳酸钙0.10，琼脂2.0，余量为水。该斜面培养基的pH自然(pH7±0.2)。38℃下，培养10天；
步骤(3)、挑选成熟的菌种斜面接种于摇瓶培养基，接种量为12％，在摇床上进行培养。该摇瓶培养基中的组分为(单位：g/L)：淀粉2.0，黄豆饼粉2.0，葡萄糖0.5，玉米粉0.5，蛋白胨0.2，KNO30.05，K2HPO40.02，碳酸钙0.4，余量为水。该摇瓶培养基的pH自然(pH7±0.2)。摇瓶在38℃，220rpm下培养50h。然后，接种于一级种子罐中的一级种子培养基上继续培养，接种量为12％。
该一级种子培养基中的组分为(单位：g/L)：淀粉1.0，黄豆饼粉1.5，玉米粉1.0，KNO30.05，蛋白胨0.2，泡敌0.04，碳酸钙0.4，余量为水。该一级种子培养基的pH为8.2。在35℃下，罐压为0.04Mpa，培养50h，移种于二级种子罐中的二级种子培养基上继续培养。
该二级种子培养基中的组分为(单位：g/L)：淀粉2.0，黄豆饼粉1.5，玉米粉0.5，葡萄糖0.5，蛋白胨0.2，KNO30.1，泡敌0.04，余量为水。该二级种子培养基的pH为8.2，接种量为12％。在35℃下，罐压为0.15Mpa，培养25h。
步骤(4)、接种于发酵罐内的发酵培养基中发酵，接种量为12％。该发酵培养基中的组分为(单位：g/L)：淀粉4.0，黄豆饼粉3.5，葡萄糖0.5，玉米粉1.5，蛋白胨0.2，KNO30.1，(NH4)2SO40.05，泡敌0.04，碳酸钙0.4，余量为水。该发酵培养基的pH为5.2，发酵在35℃下进行，发酵进行至135h放罐。
步骤(5)、对步骤(4)得到的发酵液使用微滤膜去除菌丝体及发酵液残基，在2.0bar的操作压力下，微滤膜选用截留分子量为200000的陶瓷膜，收集微滤膜透过液。
将微滤膜透过液经过超滤膜在3.0bar操作压力条件下去除蛋白质、色素和多糖等大分子杂质，超滤膜选用截留分子量为10000的聚乙烯膜，收集超滤透过液。
将收集的超滤膜透过液在8.0bar操作压力条件下经过截留分子量为500的磺化聚砜膜(一种纳滤膜)进行常温脱盐、富集，脱盐液经浓缩、干燥制得含量72％的固态庆大霉素C1a粗品。
实施例三：
该庆大霉素C1a的制备方法包括以下步骤。
步骤(1)、将庆大霉素B产生菌进行微波诱变，吸取2mL孢子液悬于EP管中，将EP管放于冰浴烧杯中，在微波炉中以700W、2450MHz处理60s；然后利用化学诱变剂进行化学诱变，化学诱变剂为亚硝基胍，诱变剂使用浓度为1.0mg/mL，在38℃下恒温培养箱中进行8h的恒温培养。筛选得到庆大霉素C1a产生菌。
步骤(2)、挑选稳定且相对高产的庆大霉素C1a产生菌，进行斜面培养，斜面培养基中的组分为(单位：g/L)：玉米淀粉2.2，KNO30.15，NaCl0.06，MgSO40.07，K2HPO40.04，小麦粉2.2，碳酸钙0.11，琼脂2.3，余量为水。该斜面培养基的pH自然(pH7±0.2)。40℃下培养15天。
步骤(3)、挑选成熟的菌种斜面接种于摇瓶培养基，接种量为15％，在摇床上进行培养。摇瓶培养基中的组分为(单位：g/L)：淀粉2.2，黄豆饼粉2.2，葡萄糖0.6，玉米粉0.7，蛋白胨0.3，KNO30.06，K2HPO40.03，碳酸钙0.5，余量为水。该种子培养基的pH自然(pH7±0.2)。摇瓶在40℃，250rpm下培养60h。然后，接种于一级种子罐中的一级种子培养基上继续培养，接种量为15％。
该一级种子培养基中的组分为(单位：g/L)：淀粉1.2，黄豆饼粉1.6，玉米粉1.2，KNO30.06，蛋白胨0.3，泡敌0.05，碳酸钙0.5，余量为水。该一级种子培养基的pH为8.0～8.4。在40℃下，罐压为0.05Mpa，培养60h，移种于二级种子罐的二级种子培养基中继续培养。
该二级种子培养基中的组分为(单位：g/L)：淀粉2.2，黄豆饼粉1.6，玉米粉0.6，葡萄糖0.6，蛋白胨0.3，KNO30.15，泡敌0.05，余量为水。该二级种子培养基的pH为8.4，接种量为15％。在40℃下，罐压为0.2Mpa，培养30h。
步骤(4)、接种于发酵罐内的发酵培养基中发酵，接种量为15％。该发酵培养基中的组分为(单位：g/L)：淀粉4.2，黄豆饼粉3.7，葡萄糖0.6，玉米粉1.6，蛋白胨0.3，KNO30.15，(NH4)2SO40.06，泡敌0.05，碳酸钙0.5，余量为水。该发酵培养基的pH为5.4。发酵在40℃下进行，发酵进行至160h放罐。
步骤(5)、对步骤(4)得到的发酵液使用微滤膜去除菌丝体，发酵液残基，在3.0bar的操作压力下，微滤膜选用截留分子量为400000微滤膜，该微滤膜的膜材料为金属。收集微滤膜透过液。
将微滤膜透过液经过超滤膜在6.0bar操作压力条件下去除蛋白质、色素和多糖等大分子杂质，超滤膜选用截留分子量为20000的聚氯乙稀膜，收集超滤膜透过液。
将收集的超滤膜透过液在10bar操作压力条件下经过截留分子量为800的聚乙烯醇膜(一种纳滤膜)进行常温脱盐、富集，脱盐液经浓缩、干燥制得含量65％的固态庆大霉素C1a粗品。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。