本发明属于分子捕获器技术领域，尤其涉及一种丙酸氯倍他索分子捕获器及其制备方法和应用。
背景技术：
糖皮质激素是以氢化可的松为结构基础改造而得到的一类临床常用药物，具有抗炎、抗过敏、抑制纤维细胞增生、减少5-羟色胺生成等作用，短期使用对皮肤有一定的嫩白作用。丙酸氯倍他索(Clobetasol propionate，CBT)为强效糖皮质激素，具有较强的抗炎、抗瘙痒等作用，临床上用于治疗神经性皮炎、接触性皮炎、脂溢性皮炎、湿疹、银屑病、红斑狼疮等皮肤病。丙酸氯倍他索属于化妆品禁用的糖皮质激素类物质，若长期使用含有这类物质的化妆品，将会引起皮肤变薄、毛细血管扩张、毛囊萎缩，一旦停用，皮肤就会发红、发痒，出现红斑、丘疹、脱屑等激素依赖性皮炎症状，过量使用还会引发血糖升高、高血压、骨质疏松、免疫功能下降及肥胖等危害。因此，我国《化妆品卫生规范》(2007年版)及欧盟化妆品规程中均明确规定，化妆品中禁用糖皮质激素。但是，近年来受到商业利益的驱使，化妆品行业滥用激素的现象呈上升趋势，这类本应严肃使用的药物被一些不良厂家和美容院当作皮肤细嫩美白的特效成分滥用，“快速美白”、“七日祛斑”、“快速消痘”等常会出现在其宣传广告中，消费者在使用前和使用中不了解其中“奥秘”，导致使用者体内激素平衡遭破坏而引发多种疾病。向化妆品中添加丙酸氯倍他索等糖皮质激素，严重危害人体健康。
化妆品大多是由各种物质组成的混合物，而其中被检测的有害物质残留往往又是微量甚至是痕量的，因此样品前处理过程对分析结果的确准性、可靠性至关重要。分子印迹固相萃取(Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction，简称MISPE)是近年发展起来的一种新型样品前处理技术，它利用分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymer，简称MIP)的特异选择性吸附机理制备固相萃取材料，由于MIP对模板分子具有特异选择性和亲合性，而且其受酸、碱、有机溶剂和加热等环境因素影响很小，可以克服化妆品样品体系复杂、预处理程序繁琐等不利因素，实现复杂样品基体中低浓度目标物的分离富集，提高固相萃取的净化效果及分析检测方法的灵敏度和准确性。
表面分子印迹技术是近年发展起来的一种构建在基质表面上的分子印迹方法。该方法是在聚合溶液中引入基质或将聚合溶液涂覆在基质上，使模板分子和功能单体的聚合反应发生在基质表面形成分子印迹聚合物薄膜，从而使分子识别位点暴露在基质表面。该法可以有效地克服传统印迹技术中印迹空穴包埋过深、模板分子难洗脱和吸附平衡时间长等问题，使模板分子能够自由地进出基质表面聚合物中的特异性识别位点。
石墨烯是一种厚度仅为一个碳原子的二维纳米材料，其内部碳原子以sp2杂化轨道紧密堆积成单层二维蜂窝状结构。石墨烯具有优异的电、热及机械性能并具有大的比表面积，是现今理想的二维纳米材料。氧化石墨烯(Graphene oxide，GO)表面随机分布着大量的羟基、羧基和环氧基等含氧官能团，较石墨烯有更好的亲水性，经功能分子的共价修饰可实现其在特定领域的应用。GO具有大的比表面积、较高的机械强度、富电子结构和化学稳定性，适合用作表面印迹聚合物的载体。将GO与表面分子印迹技术结合，制成一种新型的复合功能材料，应用于样品前处理，已展现出对增加吸附容量、提高痕量组分检测灵敏度、增强材料耐用性等巨大优势。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种制法简单、成本较低的丙酸氯倍他索分子捕获器及其制备方法和应用，所得丙酸氯倍他索分子捕获器可应用于化妆品中糖皮质激素的安全检测，以方便实现对化妆品中非法添加的丙酸氯倍他索进行选择性萃取和分离。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
丙酸氯倍他索分子捕获器，以氧化石墨烯修饰的聚乙烯滤板(以表面硅烷化的氧化石墨烯涂层在聚乙烯滤板上)作为内部支撑体，在其表面合成有丙酸氯倍他索分子印迹聚合物膜。
分子印迹聚合膜以丙酸氯倍他索为模板分子、3-氨丙基三乙氧基硅烷为功能单体、正硅酸乙酯为交联剂、冰醋酸为硅烷水解缩合剂制备。
上述丙酸氯倍他索分子捕获器的制备方法，采用表面印迹聚合法，以商品固相萃取小柱的聚乙烯微孔滤板为载体，以硅烷化氧化石墨烯修饰聚乙烯滤板；然后以修饰后的聚乙烯滤板作为内部支撑体、丙酸氯倍他索为模板分子、3-氨丙基三乙氧基硅烷为功能单体、正硅酸乙酯为交联剂、冰醋酸为硅烷水解缩合剂，按投料量比8～24片∶1～3mmol∶20～60mmol∶45～135mmol∶2～6mL发生聚合反应，再洗脱除去模板分子丙酸氯倍他索，即得。
上述丙酸氯倍他索分子捕获器的制备方法，按以下步骤操作进行：
(1)氧化石墨烯修饰聚乙烯滤板
将4片聚乙烯滤板置于乙腈中浸润数小时，取出，置广口瓶中；取浓度为11.1mg/mL氧化石墨浆体3.6mL加入到6.4mL N，N-二甲基甲酰胺中，超声分散成氧化石墨烯溶胶并转入广口瓶中，置于振荡器上室温下振荡60min，将滤板取出，50℃干燥1h；重复涂覆六次，即得氧化石墨烯涂层聚乙烯滤板；
(2)硅烷化的氧化石墨烯涂层滤板的制备
将50mL乙醇、20mL水置于烧杯中，加氨水9.0mL，混匀后转入三颈烧瓶中，然后加入20片氧化石墨烯涂层聚乙烯滤板，开启磁力搅拌；取30mL乙醇、200μL正硅酸乙酯于烧杯中，冰浴下超声混匀后，将溶液逐滴加到三颈烧瓶中，滴加完后，室温下氮气保护，反应15h；反应后的滤板用乙醇洗涤4次，乙腈平衡1次，即得硅烷化的氧化石墨烯涂层滤板；
(3)采用表面印迹聚合法制备含丙酸氯倍他索的分子印迹聚合膜
将0.47～1.41g丙酸氯倍他索和4.7～14.1mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷放入装有10～30mL乙腈的烧杯中，超声3min，形成预聚合溶液；再向烧杯中加8～24片硅烷化的氧化石墨烯涂层滤板，密封避光放置8h；加入10～30mL正硅酸乙酯、2～6mL冰醋酸、20～60mL无水乙醇，搅拌均匀，转移至三颈烧瓶中，加装搅拌器、冷凝管、温度计，通氮气除氧，30℃下恒温反应15h，在硅烷化的氧化石墨烯涂层滤板表面生成含丙酸氯倍他索的分子印迹聚合膜；
(4)分子印迹聚合膜中丙酸氯倍他索的洗脱
用镊子取出步骤(3)中的滤板，用10～30mL无水乙醇洗涤；将滤板装入滤纸筒中，以体积比8∶2和9∶1的甲醇一冰醋酸为洗脱剂，索式提取3～9h，除去模板分子丙酸氯倍他索后，自然风干，即得氧化石墨烯增效的丙酸氯倍他索分子捕获器。
丙酸氯倍他索分子捕获器在选择性分离、富集和纯化样品中丙酸氯倍他索残留的应用。
丙酸氯倍他索分子捕获器在含丙酸氯倍他索的化妆品样品分析前处理中的应用。
上述应用，按以下步骤操作进行：
(1)活化
取丙酸氯倍他索分子捕获器4片置于广口瓶中，用3mL甲醇活化，弃去废液，用3mL乙腈淋洗，将分子捕获器表面的甲醇除去，弃去废液；再用3mL乙腈平衡，弃去废液；得到活化好的丙酸氯倍他索分子捕获器；
(2)萃取
精密称取化妆品样品0.2g，置于离心管中，准确加入饱和氯化钠溶液1mL，乙腈10mL，超声提取5min，10000r/min转速下离心10min，准确移取上层乙腈提取液5mL，加入步骤(1)中的广口瓶中，与活化好的分子捕获器混合；在振荡作用下萃取2h，萃取完成后，取出分子捕获器，弃去废液；
(3)淋洗
用3mL乙腈淋洗经步骤(2)处理的分子捕获器，弃去废液；
(4)洗脱
以3～15mL甲醇为洗脱剂，对分子捕获器进行洗脱，收集洗脱液；在35℃条件下用氮气将收集得到的洗脱液吹干，得到残渣，用1mL乙睛重新溶解残渣，经0.45μm有机滤头过滤后进行高效液相色谱分析。
针对现有化妆品中糖皮质激素滥用的问题，基于表面印迹技术及氧化石墨烯增效措施，发明人设计并制备了一种丙酸氯倍他索分子捕获器，以氧化石墨烯修饰的聚乙烯滤板作为内部支撑体，在其表面合成有丙酸氯倍他索分子印迹聚合物膜。其中，分子印迹聚合膜以丙酸氯倍他索为模板分子、3-氨丙基三乙氧基硅烷为功能单体、正硅酸乙酯为交联剂、冰醋酸为硅烷水解缩合剂制备。该丙酸氯倍他索分子捕获器系一种新型的分子印迹-固相萃取整体材料，由于对模板分子的作用位点多、作用力强，在分子印迹聚合物的制备过程中可以形成更有效的识别位点，从而使分子捕获器对模板分子的萃取效率和吸附容量得到提高，能实现对丙酸氯倍他索的特异性、选择性分离和富集。将本发明用于基质复杂的化妆品样品分析前处理中非法添加的痕量丙酸氯倍他索的选择吸附及动态萃取分离，可实现对丙酸氯倍他索的快速分离检测。据此，发明人还建立了丙酸氯倍他索分子捕获器的制备方法，其制法简单、成本较低，而且具有有机溶剂使用更少、固相萃取操作更为简单、快速、高效等特点。
附图说明
图1是应用本发明处理聚乙烯滤板前后对比图。
图中：左为聚乙烯滤板，右为氧化石墨烯增效的分子捕获器。
具体实施方式
实施例1
一、丙酸氯倍他索分子捕获器的制备
(1)氧化石墨烯修饰聚乙烯滤板
将4片聚乙烯滤板(直径5～10mm，厚2～3mm)置于乙腈中浸润数小时，取出，置广口瓶中；取浓度为11.1mg/mL氧化石墨浆体3.6mL加入到6.4mL N，N-二甲基甲酰胺中，超声分散成氧化石墨烯溶胶并转入广口瓶中，置于振荡器上室温下振荡60min，将滤板取出，50℃干燥1h；重复涂覆六次，即得氧化石墨烯涂层聚乙烯滤板；
(2)硅烷化的氧化石墨烯涂层滤板的制备
将50mL乙醇、20mL水置于烧杯中，加氨水9.0mL，混匀后转入三颈烧瓶中，然后加入20片氧化石墨烯涂层聚乙烯滤板，开启磁力搅拌；取30mL乙醇、200μL正硅酸乙酯于烧杯中，冰浴下超声混匀后，将溶液逐滴加到三颈烧瓶中，滴加完后，室温下氮气保护，反应15h；反应后的滤板用乙醇洗涤4次，乙腈平衡1次，即得硅烷化的氧化石墨烯涂层滤板；
(3)采用表面印迹聚合法制备含丙酸氯倍他索的分子印迹聚合膜
将0.47g丙酸氯倍他索和4.7mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷放入装有10mL乙腈的烧杯中，超声3min，形成预聚合溶液；再向烧杯中加8片硅烷化的氧化石墨烯涂层滤板，密封避光放置8h；加入10mL正硅酸乙酯、2mL冰醋酸、20mL无水乙醇，搅拌均匀，转移至三颈烧瓶中，加装搅拌器、冷凝管、温度计，通氮气除氧，30℃下恒温反应15h，在硅烷化的氧化石墨烯涂层滤板表面生成含丙酸氯倍他索的分子印迹聚合膜；
(4)分子印迹聚合膜中丙酸氯倍他索的洗脱
用镊子取出步骤(3)中的滤板，用10mL无水乙醇洗涤；将滤板装入滤纸筒中，以体积比8∶2和9∶1的甲醇-冰醋酸为洗脱剂，索式提取3～9h，除去模板分子丙酸氯倍他索后，自然风干，即得氧化石墨烯增效的丙酸氯倍他索分子捕获器。
二、丙酸氯倍他索分子捕获器应用于胶原蛋白紧致弹润蚕丝面膜中丙酸氯倍他索的选择性分离、富集和纯化
(1)取丙酸氯倍他索分子捕获器4片，置于广口瓶中，依次用3mL甲醇活化，3mL乙腈淋洗，3mL乙腈平衡，弃去废液；得到活化好的分子捕获器；
(2)准确称取市售胶原蛋白紧致弹润蚕丝面膜0.2g，置于离心管中，准确加入饱和氯化钠溶液1mL，乙腈10mL，0.1mg/mL的丙酸氯倍他索对照品乙腈溶液10μL，超声提取5min，10000r/min转速下离心10min，准确移取上层乙腈提取液5mL，加入步骤(1)中的广口瓶中，与活化好的分子捕获器混合，在振荡作用下萃取2h；用镊子取出分子捕获器，用3mL乙腈淋洗分子捕获器，弃去废液；
(3)用甲醇(3mL×5次)洗脱，收集洗脱液，在35℃条件下用氮气将收集得到的洗脱液吹干，得到残渣，用1mL乙睛重新溶解残渣，经0.45μm有机滤头过滤后进行高效液相色谱分析。
结果：分子捕获器对胶原蛋白紧致弹润蚕丝面膜中的丙酸氯倍他索具有专一选择性的分离富集和纯化能力，对胶原蛋白紧致弹润蚕丝面膜样品中加标回收率为79.8％，相对标准偏差为1.36％。
实施例2
一、丙酸氯倍他索分子捕获器的制备
步骤(1)、(2)同实施例1。
(3)采用表面印迹聚合法制备含丙酸氯倍他索的分子印迹聚合膜
将0.94g丙酸氯倍他索和9.4mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷放入装有20mL乙腈的烧杯中，超声3min，形成预聚合溶液；再向烧杯中加16片硅烷化的氧化石墨烯涂层滤板，密封避光放置8h；加入20mL正硅酸乙酯、4mL冰醋酸、40mL无水乙醇，搅拌均匀，转移至三颈烧瓶中，加装搅拌器、冷凝管、温度计，通氮气除氧，30℃下恒温反应15h，在硅烷化的氧化石墨烯涂层滤板表面生成含丙酸氯倍他索的分子印迹聚合膜；
(4)分子印迹聚合膜中丙酸氯倍他索的洗脱
用镊子取出步骤(3)中的滤板，用20mL无水乙醇洗涤；将滤板装入滤纸筒中，以体积比8∶2和9∶1的甲醇-冰醋酸为洗脱剂，索式提取3～9h，除去模板分子丙酸氯倍他索后，自然风干，即得氧化石墨烯增效的丙酸氯倍他索分子捕获器。
二、丙酸氯倍他索分子捕获器应用于松茸蜗牛修护臻养面膜中丙酸氯倍他索的选择性分离、富集和纯化
具体操作参照实施例1中丙酸氯倍他索分子捕获器对胶原蛋白紧致弹润蚕丝面膜的处理。
结果：分子捕获器对松茸蜗牛修护臻养面膜中的丙酸氯倍他索具有专一选择性的分离富集和纯化能力，对松茸蜗牛修护臻养面膜样品中加标回收率为76.15％，相对标准偏差为0.95％。
实施例3
一、丙酸氯倍他索分子捕获器的制备
步骤(1)、(2)同实施例1。
(3)采用表面印迹聚合法制备含丙酸氯倍他索的分子印迹聚合膜
将1.41g丙酸氯倍他索和14.1mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷放入装有30mL乙腈的烧杯中，超声3min，形成预聚合溶液；再向烧杯中加24片硅烷化的氧化石墨烯涂层滤板，密封避光放置8h；加入30mL正硅酸乙酯、6mL冰醋酸、60mL无水乙醇，搅拌均匀，转移至三颈烧瓶中，加装搅拌器、冷凝管、温度计，通氮气除氧，30℃下恒温反应15h，在硅烷化的氧化石墨烯涂层滤板表面生成含丙酸氯倍他索的分子印迹聚合膜；
(4)分子印迹聚合膜中丙酸氯倍他索的洗脱
用镊子取出步骤(3)中的滤板，用30mL无水乙醇洗涤；将滤板装入滤纸筒中，以体积比8∶2和9∶1的甲醇-冰醋酸为洗脱剂，索式提取3～9h，除去模板分子丙酸氯倍他索后，自然风干，即得氧化石墨烯增效的丙酸氯倍他索分子捕获器。
二、丙酸氯倍他索分子捕获器应用于芦荟痘胶膏中丙酸氯倍他索的选择性分离、富集和纯化
具体操作参照实施例1中丙酸氯倍他索分子捕获器对胶原蛋白紧致弹润蚕丝面膜的处理。
结果：分子捕获器对芦荟痘胶膏中的丙酸氯倍他索具有专一选择性的分离富集和纯化能力，对芦荟痘胶膏样品中加标回收率为77.77％，相对标准偏差为0.23％。
实施例4
一、分子印迹聚合物与非印迹聚合物的制备
为了评价所制备的丙酸氯倍他索分子印迹聚合物(MIP)对模板分子丙酸氯倍他索的分子识别性，作为对比，同时合成了非印迹聚合物(NIP)，其制备方法与上述实施例中的MIP基本相同，仅不加模板分子。
二、分子印迹聚合物对模板分子丙酸氯倍他索的分子识别性研究
泼尼松、地塞米松与模板分子丙酸氯倍他索结构类似，通过比较MIP对模板分子丙酸氯倍他索及其结构相似物的吸附行为上的差异，来评价其分子识别性。
(1)吸附量的测定
取泼尼松、地塞米松和丙酸氯倍他索对照品适量，分别用乙腈配制成2mg/mL溶液。取4片MIP和NIP(共3组)，分别置于广口瓶中，分别准确加入上述泼尼松、地塞米松和丙酸氯倍他索溶液10mL，置于振荡器上室温振荡(90r/min)2h，精密量取上清液适量，用乙腈稀释定容，在234nm处测定吸光度。
根据公式Q＝(C0-Ce)V/m，通过吸附前后溶液浓度变化计算聚合物吸附量。公式中，Q为平衡吸附量(mg/g)；C0与Ce分别为各底物的初始浓度与吸附平衡浓度(mg/mL)；V为溶液的体积(mL)；m为分子捕获器中MIP膜或NIP膜的质量(g)。
用吸附容量差值ΔQ评价MIP对模板分子的特异吸附性，ΔQ＝QMIP-QNIP。式中QMIP为MIP对底物的吸附量(mg/g)；QNIP为NIP对底物的吸附量(mg/g)，ΔQ值越大，特异分离效果越好，说明MIP对模板分子的分离富集能力越强。
(2)分子印迹聚合物对模板分子丙酸氯倍他索的分子识别性研究结果(见表1)
表1分子印迹聚合物对模板分子丙酸氯倍他索的分子识别性研究结果
由于MIP的印迹空穴及结合位点与模板分子丙酸氯倍他索具有高度的匹配性，所以其对丙酸氯倍他索具有较强的富集能力，吸附量及吸附容量差值均较高，表现出较好的分离富集能力；泼尼松、地塞米松在结构上虽然与丙酸氯倍他索相似，但仍有一定差异。因此，二者与MIP的空穴结构和结合位点不具备完全匹配性，所以MIP对泼尼松和地塞米松的吸附量较小。实验结果表明，丙酸氯倍他索分子印迹聚合物对丙酸氯倍他索具有优良的分离富集能力。
结论：本发明将GO涂层在聚乙烯筛板表面制得氧化石墨烯涂层滤板，从而提高材料的吸附容量及传质速率；再以GO涂层滤板为支撑体，采用预组装或自组装的方法对其表面进行修饰，然后在其表面接枝MIP薄膜，可以制备出一系列具有不同识别位点和空腔结构的GO涂层滤板表面分子印迹聚合物，从而解决丙酸氯倍他索等糖皮质激素MIP合成和识别中存在的技术问题。
所得氧化石墨烯增效的分子捕获器是由氧化石墨烯增效的分子印迹聚合物和固相萃取滤板复合而成的新型萃取整体分离材料。它以氧化石墨烯涂层滤板为内部支撑体，其表面则键合了分子印迹聚合膜，其既具有MIP的诸多特点，如对模板分子具有特异吸附性和分离选择性，通过吸附或共价结合的方式与待分离组分结合；同时，又具有固相萃取简易分离的特征，在完成对模板分子的识别与吸附后，可直接用镊子将分子捕获器从样品基质中取出，无需高速离心、磁分离等外场作用，操作快速简便，因此特别适合于复杂体系中目标物的分离富集。
实验研究表明，相对于现有技术，本发明的突出优点如下：
1.氧化石墨烯增效的分子捕获器制备方法操作简单，适用性广。
2.聚合反应前，用氧化石墨烯对聚乙烯滤板表面进行涂层，可有效增大分子捕获器内部支撑体的比表面积；对氧化石墨烯涂层滤板进行硅烷化修饰，使氧化石墨烯在滤板表面附着更为牢固；同时，由于氨基的引入，使其与模板分子及功能单体通过形成氢键很好地包埋在聚合物里。
3.由于聚乙烯滤板本身具有多孔结构，涂覆氧化石墨烯后，进一步增大反应比表面积，形成的印迹膜铺展于氧化石墨烯的表面，呈现出多孔结构，使暴露在表面的印迹位点更多，模板洗脱更完全，再结合模板分子的空间位阻更小，吸附更迅速，分离富集效果更好。
4.氧化石墨烯增效的分子捕获器，具有对模板分子有“记忆”功能的空穴和亲合位点，使印迹聚合物与模板分子的再结合过程发生在表面，因此，可以实现对模板分子的快速吸附平衡。
5.本发明采用表面印迹法合成，克服了传统包埋法存在的空间位阻大的问题，使模板分子能够自由地进出支撑体表面聚合物中的特异性识别空穴及位点，使固相萃取整体材料的传质速率加快。
6.传统的分子印迹聚合物在用于样品前处理时，需将吸附材料填装至固相萃取小柱中，经活化、加样、淋洗、洗脱，完成分离富集的前处理过程；本发明的分子捕获器，在吸附萃取模板分子过程中，无需填充装柱，而是直接将其加入到被测样品的提取液中进行吸附富集，即可快速完成对模板分子的萃取。萃取结束后，直接取出分子捕获器，即可实现与样品基质的分离，快速清除样品中的基质干扰，大大简化了分析步骤，节约分析时间，降低有机溶剂的消耗，从而实现对模板分子的快速检测分析。