一种山羊miR‑27a定点修饰系统及其应用的制作方法

本发明属于动物基因工程
技术领域：
，具体涉及一种山羊mir-27a定点修饰系统及其应用特别是涉及到对某些特定功能转录因子与目的基因启动子结合位点序列的编辑工作，例如在本发明中阐述的将mir-27a启动子区中转录因子cp2的结合位点进行修饰，从而改变cp2与mir-27a启动子的结合能力。
背景技术：
：microrna(mirna)是由内源性基因编码的单链非编码rna，长度一般为16-29核苷酸(nucleotide,nt)左右，通过与靶基因mrna的3’utr互补配对来调控其转录后的表达水平(gu,2009.gus,jinl,zhangf,sarnowp,kayma.biologicalbasisforrestrictionofmicrornatargetstothe3'untranslatedregioninmammalianmrnas.natstructmolbiol.2009feb；16(2):144-50)。作为一种小分子序列，mirna可以全局调控基因的表达，功能涉及到组织生长、细胞凋亡、脂肪代谢、卵细胞发育、精子发生等重要生命过程(brenneckeetal.2003.bantamencodesadevelopmentallyregulatedmicrornathatcontrolscellproliferationandregulatestheproapoptoticgenehidindrosophila.cell.113:25-26；yuetal.2005.micrornamirn122areducesexpressionofthepost-transcriptionallyregulatedgermcelltransitionprotein2(tnp2)messengerrna(mrna)bymrnacleavage.biologyofreproduction.73:427-433)。例如，mir-21、mir-212和mir-132在小鼠颗粒细胞中呈显著的上调表达，并且当mir-21的表达量降低时会导致颗粒细胞凋亡(carlettietal.,2010.carlettimz,fiedlersd,christensonlk.microrna21blocksapoptosisinmouseperiovulatorygranulosacells.biolreprod.2010aug1；83(2):286-95)。在小鼠颗粒细胞中筛选出多个受tgf-β1信号调控的mirna，其中mir-224可以靶向作用于smad4基因来调控颗粒细胞的增殖(yaoetal.,2010.yaog,yinm,lianj,tianh,liul,lix,sunf.microrna-224isinvolvedintransforminggrowthfactor-beta-mediatedmousegranulosacellproliferationandgranulosacellfunctionbytargetingsmad4.molendocrinol.2010mar；24(3):540-51)。有国外有研究团队通过高通量检测，在颗粒细胞中筛选出大量抑制雌激素分泌的mirna，此外mir-28,mir-126,mir-105和mir-188等还可同时抑制雄激素和孕酮的分泌(sirotkinetal.,2009.sirotkinav,ovcharenkod,grossmannr,laukovám,mlyncekm.identificationofmicrornascontrollinghumanovariancellsteroidogenesisviaagenome-scalescreen.jcellphysiol.2009may；219(2):415-20)。dicer1-/-雌鼠的卵母细胞中纺锤体发生异常，导致其不能完成第一次减数分裂(murchisoneta1.,2007.murchisonep,steinp,xuanz,panh,zhangmq,schultzrm,hannongj.criticalrolesfordicerinthefemalegermline.genesdev.2007mar15；21(6):682-93)。对于卵泡发育而言，mirna是一类发挥重要调控作用的小分子调控物。养羊业在畜牧业中占有重要地位。繁殖是决定规模化养殖产出的一大主要经济性状。繁殖性状属于数量性状，具有遗传力低、选择周期长、选育进展慢等缺陷，成为制约养羊产业经济效益的主要原因。山羊尽管属于多胎动物，其每窝产羔数远远低于猪，在母畜繁殖性能对总效益值的所占的贡献比猪大。因此，提高羊的繁殖性能尤为重要。排卵率是产仔数性状的重要组分性状，卵巢中卵泡的生长发育决定了排卵数。因此探索卵巢中基因表达情况、发育规律和调控因素，对于揭示排卵率的遗传调控机制，进行高繁殖力品种的选育具有重要意义。综上所述，在山羊卵泡的发育过程中mirna发挥着重要作用。mirna多数是通过与靶基因的3’utr区序列特异性识别来实现对基因表达的调控作用，其前体也会受到特定转录因子的调控作用。因此，通过定点修饰转录因子cp2在mir-27a启动子中的结合位点，可用于构建相应双荧光素酶报告载体，研究转录因子的具体调控作用。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种山羊mir-27a定点修饰体系及其在山羊mir-27a启动子区域对转录因子cp2结合位点进行修饰的应用方法。本发明特别是涉及到对某些特定功能转录因子与目的基因启动子结合位点序列的编辑工作，例如在本发明中阐述的将mir-27a启动子区中转录因子cp2的结合位点进行修饰，从而改变cp2与mir-27a启动子的结合能力。本发明的技术方案如下所述：一种山羊mir-27a定点修饰系统,发明的要点在于：由山羊mir-27a的双荧光素酶报告基因载体pgl3-w和突变修饰后获得的载体pgl3-m构成，所述的pgl3-w载体包含有seqidno：2所示的核苷酸序列，pgl3-m载体包含有seqidno：9所示的核苷酸序列，两段序列均位于山羊mir-27a的5’utr区段，通过如下步骤制备得到：(1)以登录号为nc_030814(genebank登录号nc_030814)的山羊mir-27a前体序列，利用ncbi数据库检索工具往前延伸1000bp为扩增模板，其核苷酸序列如seqidno：1所示；利用上述扩增模板，通过touch-downpcr方法克隆获得mir-27a前体5’utr区段，测序验证序列正确性，其核苷酸序列如seqidno：2所示；(2)利用jaspar数据库(http://jaspar.genereg.net/)，预测得到山羊mir-27a的5’utr启动子区中包含转录因子cp2的结合位点，其序列为gctgctgccacacccaggg；(3)将步骤(1)扩增得到的序列插入双荧光素酶报告基因载体pgl3(见图6)中，通过酶切、连接、转化感受态细胞、筛选阳性克隆并测序验证和抽提重组质粒，获得野生型双荧光素酶报告基因载体pgl3-w，其序列如seqidno：2所示；(4)将步骤(3)构建的pgl3-w载体，针对需要修饰的转录因子cp2结合位点，设计如seqidno：5和seqidno：6所示序列的突变引物，利用seqidno：3和seqidno：6所示序列的引物对pcr扩增出如seqidno：7所示序列的目的片段；利用seqidno：5和seqidno：4所示序列的引物对pcr扩增出如seqidno：8所示序列的目的片段；将seqidno：7和seqidno：8所示的序列通过融合pcr进行连接；以连接后产物为模板，以seqidno：3和seqidno：4所示序列为引物对，得到pcr扩增产物，其序列如seqidno：9所示，通过酶切、连接、转化感受态细胞、筛选阳性克隆并测序验证、抽提重组质粒，得到转录因子cp2的结合位点突变型载体pgl3-m；融合pcr的扩增条件为：95℃5min；95℃30s，30℃30s，35℃5s，40℃5s，45℃5s，50℃5，、55℃5s，60℃5s，65℃5s，72℃30s，共计30个循环；72℃10min；于4℃保存。申请人提供了一种扩增山羊mir-27a的5’utr区的touch-downpcr引物对，所述引物对的序列如下所示：上游引物：ctagctagcagtggtttcctcctgcccttca，下游引物：cccaagctcccttgccgccatcctttg-3。在本发明中，申请人还提出了一种对山羊mir-27a启动子区中转录因子cp2结合位点进行突变修饰的pcr引物对，所述引物对的序列如下所示：正向引物：tggtatctttagctatgatactacccagggatgggg，反向引物：ccccatccctgggtagtatcatagctaaagatacca。申请人提供了一种用于非诊断目的的一种山羊mir-27a定点修饰系统的制备方法,所述的方法包括由山羊mir-27a的双荧光素酶报告基因载体pgl3-w和突变修饰后获得的载体pgl3-m构成，所述的pgl3-w载体包含有seqidno：2所示的核苷酸序列，pgl3-m载体包含有seqidno：9所示的核苷酸序列，两段序列均位于山羊mir-27a的5’utr区段，通过如下步骤制备得到：(1)以登录号为nc_030814(genebank登录号nc_030814)的山羊mir-27a前体序列，利用ncbi数据库检索工具往前延伸1000bp为扩增模板，其核苷酸序列如seqidno：1所示；利用上述扩增模板，通过touch-downpcr方法克隆获得mir-27a前体5’utr片段，其核苷酸序列如seqidno：2所示；(2)利用jaspar数据库(http://jaspar.genereg.net/)，预测得到山羊mir-27a的5’utr启动子区中包含转录因子cp2的结合位点，其序列为gctgctgccacacccaggg；(3)将步骤(1)扩增得到的序列插入双荧光素酶报告基因载体pgl3(见图6)中，通过酶切、连接、转化感受态细胞、筛选阳性克隆并测序验证和抽提重组质粒，获得野生型双荧光素酶报告基因载体pgl3-w，其序列如seqidno：2所示；(4)将步骤(3)构建的pgl3-w载体，针对需要修饰的转录因子cp2结合位点，设计如seqidno：5和seqidno：6所示序列的突变引物，利用seqidno：3和seqidno：6所示序列的引物对pcr扩增出如seqidno：7所示序列的目的片段；利用seqidno：5和seqidno：4所示序列的引物对pcr扩增出如seqidno：8所示序列的目的片段；将seqidno：7和seqidno：8所示的序列通过融合pcr进行连接；以连接后产物为模板，以seqidno：3和seqidno：4所示序列为引物对，得到pcr扩增产物，其序列如seqidno：9所示，通过酶切、连接、转化感受态细胞、筛选阳性克隆并测序验证、抽提重组质粒，得到转录因子cp2的结合位点突变型载体pgl3-m；融合pcr的扩增条件为：95℃5min；95℃30s，30℃30s，35℃5s，40℃5s，45℃5s，50℃5，、55℃5s，60℃5s，65℃5s，72℃30s，共计30个循环；72℃10min；于4℃保存。本发明的双荧光素酶报告载体pgl3-w和pgl3-m，可用于对候选转录因子p53对山羊mir-27a表达的调控活性的检测，用于筛选可调控山羊mir-27a表达的重要转录因子。更详细技术方案和发明效果如《具体实施方式》所述。附图说明序列表seqidno：1：是山羊mir-27a潜在启动子区段，序列长度为1083bp。序列表seqidno：2：是通过扩增测序获得的包含转录因子cp2的片段，序列长678bp。序列表seqidno：3：是快速扩增包含转录因子cp2序列的touch-downpcr上游引物。序列表seqidno：4：是快速扩增包含转录因子cp2序列的touch-downpcr下游引物。序列表seqidno：5：是用于对转录因子cp2结合位点进行修饰的上游突变引物。序列表seqidno：6：是用于对转录因子cp2结合位点进行修饰的下游突变引物。序列表seqidno：7：是由seqidno.3和seqidno.6引物扩增测序获得突变片段。序列表seqidno：8：是由seqidno.5和seqidno.4引物扩增测序获得突变片段。序列表seqidno：9：是扩增测序获得的包含突变转录因子cp2结合位点的片段，序列长度为678bp。图1：是本发明的总体技术流程图。图2：是山羊mir-27a的启动子区扩增结果图。附图标记说明：在图2中：泳道m是dl2000dnamarker，泳道1是目的扩增片段。图3：是重叠片段seqidno：7和seqidno：8扩增结果图。附图标记说明：在图3中：泳道m是dl2000dnamarker，泳道1是seqidno.7的扩增片段,泳道2是seqidno.8的扩增片段。图4：是山羊mir-27a的启动子区中转录因子cp2突变修饰后扩增结果。附图标记说明：在图3中：泳道m是dl2000dnamarker，泳道1是seqidno：9的扩增片段.图5：是商业载体(质粒)pmd18-t的结构图谱。图6：是空载体pgl3-basic的结构图谱。图7：是内参载体prl-tk的结构图谱图8：是用pgl3-w和pgl3-m分别转染cho细胞24h后相对荧光素酶活性检测结果。附图标记说明：在图8中：纵坐标relatedluciferaseactivity表示相对荧光素酶活性值，basic为空白对照，**p<0.01。具体实施方式实施例11.山羊mir-27a启动子区分析与扩增1.1山羊组织dna提取与检测利用北京百泰克生物技术有限公司提供的细胞/组织基因组dna提取试剂盒(离心柱型)来进行山羊卵泡组织全基因组dna的提取，将提取的dna于-20℃下保存备用。基因组dna浓度测定：使用nanodrop2000型dna/rna浓度测定仪，测定dna浓度和od值，按照所测浓度将管中的dna做相应稀释，以50ng/μl分装，于-20℃保存。基因组dna质量检测：取3μldna点样于1％的琼脂糖凝胶(eb染色液)上，同时点5μl标准分子量dl2000dnamarker作为参照。15v/cm条件下电泳，然后在凝胶成像系统中观察结果并拍照保存。1.2mir-27a启动子生物信息学分析根据genebank山羊mir-27a前体序列(genebank登录号nc_030814)，利用ncbi数据库检索工具往前延伸1000bp，利用jaspar数据库(http://jaspar.genereg.net/)对该区域进行转录因子扫描，结果发现343-361位核苷酸(序列为gctgctgccacacccaggg)为转录因子cp2(genebank登录号nc_030812.1)的结合区域。1.3引物设计以mir-27a前体启动子区为模板，利用primer5设计用于扩增获得山羊mir-27a前体的5’utr区片段的touch-downpcr引物(5’端分别添加nhei和hindiii酶切位点及保护碱基见引物中下划线部分)，引物序列如下：上游引物：5'-ctagctagcagtggtttcctcctgcccttca-3'(对应于seqidno：3)下游引物：5'-cccaagctcccttgccgccatcctttg-3'(对应于seqidno：4)1.4扩增山羊mir-27a启动子片段和回收利用设计的引物seqidno：3和seqidno：4，以山羊全基因组dna为模板，通过touch-downpcr扩增得到山羊mir-27a启动子的5’utr片段，该片段全长为678bp(见图2)。touch-downpcr反应程序见表1。pcr反应体系见表2。表1touch-downpcr反应程序表2pcr反应体系(50μl)组分体积(μl)pcrmix250.5μmol/l上游引物0.50.5μmol/l下游引物0.5dna50-200ng加去离子水至50取5μlpcr扩增产物，加0.5μlloadingbuffer(试剂盒自带)，混匀后点样于2％的琼脂糖凝胶上，以5μldna标准分子量dl2000marker作为参照，15v/cm电泳，电泳结束后，在凝胶成像系统中观察结果并拍照保存。pcr产物采用omegabio-tek公司的凝胶回收试剂盒切胶回收，具体操作步骤按照该试剂盒说明书进行。1.5克隆并测序验证回收后的pcr产物连接宝生物工程大连有限公司生产的pmd18-t载体(见图5)，连接反应总体系10μl，置于16℃条件下连接1h。pcr反应体系见表3。表3pcr反应体系(10μl)无菌条件下取10μl连接产物加入到50μldh5α感受态细胞中，混匀后静置冰浴30min，42℃热激90s，立即置于冰上2-3min，加入400μl不含amp抗生素的lb液体培养基，置于37℃恒温摇床培养45min，低速离心(<5000g)，留150μl上清，其余弃除。将剩余上清吹打混匀然后均匀涂布于平板(含有100mg/l的amp)上，平放于37℃恒温培养箱中约1h，之后倒置过夜培养。用小枪头挑取平板上形态正常的单菌落，置于含400μllb液体培养基(附加100mg/lamp)的1.5mlependorff管中，于37℃恒温摇床培养8h。取lμl菌液作为pcr扩增的模板，pcr扩增体系和程序参见1.4。pcr扩增产物用浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并在凝胶成像系统中拍照记录。经菌液pcr检测，结果为阳性的含重组质粒的菌液送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序。2.构建山羊mir-27a启动子5’utr荧光素酶报告载体2.1载体pgl3basic扩增载体pgl3basic(见图6)，经过大肠杆菌dh5α扩增后，使用去内毒素质粒小量提取抽提试剂盒(omegae.z.n.a.tmendo-freeplasmidminikitispin)进行抽提载体dna，具体步骤见试剂盒的说明书。2.2双酶切由2.1中抽提的pgl3basic质粒和1.4中回收纯化的pcr产物，分别用nhei和hindiii限制性内切酶进行双酶切，所用内切酶均购自neb。双酶切反应体系见表4。表4双酶切反应体系(10μl)组分体积(μl)nheⅰ0.5hindⅲ0.5buffer1质粒14质粒24体系于37℃酶切3h。酶切产物在2％琼脂糖凝胶电泳，采用过柱离心的方法回收。2.3连接将酶切后纯化的载体pgl3basic和mir-27a的5’utr片段，用t4连接酶16℃连接2h。连接体系见表5。表5连接体系(10μl)组分体积(μl)5’utr片段7pgl3basic1t4dnaligase1buffer12.4克隆并测序验证采用1.5中的方法进行重组载体pgl3-w的克隆和测序验证。2.5重组质粒的抽提使用去内毒素质粒小量提取抽提试剂盒(omegae.z.n.a.tmendo-freeplasmidminikitispin)进行抽提载体dna，具体步骤见试剂盒的说明书。3.构建转录因子cp2结合位点突变型荧光素酶报告载体3.1结合位点突变型引物设计先将转录因子cp2的结合位点gctgctgccacacccaggg突变为gctatgatactacccaggg，下划线部分为突变的8个碱基位点。利用primer5设计用于扩增的突变型pcr引物，突变型引物完全互补，具体引物序列如下：正向引物：5'-tggtatctttagctatgatactacccagggatgggg-3'(对应于seqidno：5)反向引物：5'-ccccatccctgggtagtatcatagctaaagatacca-3'(对应于seqidno：6)3.2重叠片段的扩增将seqidno：3的序列作为上游引物，seqidno：6的序列作为下游引物，扩增出重叠片段seqidno：7；将seqidno：5序列作为上游引物和seqidno：4的序列作为下游引物，扩增出重叠片段seqidno：8(见图3)。seqidno：7和seqidn：8重叠部分为tggtatctttagctatgatactacccagggatgggg(下划线部分为突变后的碱基序列)。3.3重叠片段的融合seqidno：7和seqidno：8所述的片段需要通过融合pcr程序(见表6)进行连接，将二者连接为一体，形成与如1.4中除突变位点外均完全一致的678bp片段(图4)。表6融合pcr程序(10μl)3.4突变型片段的扩增以3.3中的转录因子cp2结合位点突变后的重叠片段为模板，仍然使用seqidno：3和seqidno：4的序列为引物，利用touch-downpcr扩增得到目的片段。具体步骤参见1.4所述。3.5突变型载体构建构建方法同2中所述，测序结果如seqidno：9所示。4.山羊野生型和突变型转录因子cp2荧光素酶报告载体的应用4.1利用荧光报告载体转染cho(仓鼠卵巢细胞)细胞(1)在转染前1天，5×104细胞接种于24孔板内，继续培养至细胞密度到80％；(2)将每孔转染的0.8μg质粒加入50μlopti-mem培养基(购于hyclone公司)中混匀，取2.0μllipofectamine2000和1/20μgprl-tk(图7)加入50μlopti-mem培养基中混匀，将上述两份混合液在室温下静置5min；(3)将步骤(2)中的两份混合液混合均匀，室温静置20min；(4)期间吸除各孔中原有的细胞培养基，用opti-mem清洗两遍；(5)将每孔细胞加入步骤(3)中混合液100μl，后用opti-mem补至为500μl；(6)置于37℃，5％co2细胞培养箱培养24h后收集细胞，利用1×plb(passivelysisbuffer，试剂盒自带)裂解细胞，将获得的蛋白置于-70℃冰箱中保存。4.2双荧光素酶活性检测利用dual-luciferasereporterassaysystem在多功能酶标仪中检测荧光载体的相对荧光活性：吸取10μl2.6.2.4中获得的细胞裂解液加入酶标板中，首先加入50μl的larⅱ读取样品中荧火虫荧光素酶的活性值a，加入50μl的stop&gloreagent读取样品中海肾荧光素酶的活性值b。a/b比值即代表该荧光载体的活性，采用sas8.0软件对所得结果进行单因素方差分析，p<0.05时为差异显著，p<0.01时为差异极显著。相对荧光活性检测结果如图8所示。结果表明，相对于阴性对照basic而言，pgl3-w载体的荧光活性有显著的上升，说明构建pgl3-w载体的mir-27a启动子片段具有活性，当对该启动子片段中的转录因子cp2的结合位点进行突变修饰后丧失了与cp2蛋白的结合能力，所构建的突变型载体pgl3-m的荧光活性较之pgl3-w有显著的升高，说明转录因子cp2对于mir-27a启动子的荧光活性具有抑制作用，进而得出结论cp2较有可能抑制mir-27a的表达。sequencelisting<110>华中农业大学<120>一种山羊mir-27a定点修饰系统及其应用<130><141>2016-11-07<160>9<170>patentinversion3.1<210>1<211>1083<212>dna<213>山羊<220><221>promoter<222>(1)..(1083)<223><400>1aggcctggccactgaggagacgggaccatggggggaggccctagtggtttcctcctgccc60ttcaggcttctaggaagtggcgccagctggggtgagatcacttcctcagccgcctgcccg120ccaccccctcagcttcctctccccatggccccatttagcctgcccagggctccgtgctgc180gggcggggcgggggtgggggtgggggctcggccaaggaatggagtgggtgctggctctgg240gagttcctacagcctccttggccgaaagtgactctgtgggtatctctacttctctgggtc300tgggaagcctggctgggggtgtccagcctggtggtatctttagctgctgccacacccagg360gatgggggagcctggagggctgccgtctatggggtcgcacagagtcggacacgactgaag420cgacttagccgcagcagcagcacatgcggaaggccttcccgggtggcgctagtggtaaag480agcccgcctgccaacgcaggagacaagagaacgagggttcgatccctgggtggcgaagat540tccctggaggagggcatggcaacccactccagtattcttgcctggagaatcccatggaca600ggggagcctgatgggctatagtccgtggggtcgcaagagtcagacacgactgaagcgacg660gcacggacgcacatggggaaagcggcttctctgcgagacctcaaaggatggcggcaaggg720gggacatggaaggcaggtgtcctcaaatctcacgacctcctttcgtctctcctaggtgcc780agctgctggccctgcccggtgccctgcccctcgaccctggtgccatggccggctggggtt840cctggggatgggatttgctgcctgtcacaaatcacattgccagggatttccaaccgaccc900tgagccctgcctccggggccgccactgccactgccgccgctgaggacgctgaccctgggg960atggggatggggtggcagagaggcccccaccgctcacatctggcctggggagcagggctt1020agctgcttgtgagcaggtccacatcaagtcgtgttcacagtggctaagttccgccccccc1080ggg1083<210>2<211>678<212>dna<213>山羊<220><221>gene<222>(1)..(678)<223><400>2agtggtttcctcctgcccttcaggcttctaggaagtggcgccagctggggtgagatcact60tcctcagccgcctgcccgccaccccctcagcttcctctccccatggccccatttagcctg120cccagggctccgtgctgcgggcggggcgggggtgggggtgggggctcggccaaggaatgg180agtgggtgctggctctgggagttcctacagcctccttggccgaaagtgactctgtgggta240tctctacttctctgggtctgggaagcctggctgggggtgtccagcctggtggtatcttta300gctgctgccacacccagggatgggggagcctggagggctgccgtctatggggtcgcacag360agtcggacacgactgaagcgacttagccgcagcagcagcacatgcggaaggccttcccgg420gtggcgctagtggtaaagagcccgcctgccaacgcaggagacaagagaacgagggttcga480tccctgggtggcgaagattccctggaggagggcatggcaacccactccagtattcttgcc540tggagaatcccatggacaggggagcctgatgggctatagtccgtggggtcgcaagagtca600gacacgactgaagcgacggcacggacgcacatggggaaagcggcttctctgcgagacctc660aaaggatggcggcaaggg678<210>3<211>31<212>dna<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1)..(31)<223><400>3ctagctagcagtggtttcctcctgcccttca31<210>4<211>27<212>dna<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1)..(27)<223><400>4cccaagctcccttgccgccatcctttg27<210>5<211>36<212>dna<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1)..(36)<223><400>5tggtatctttagctatgatactacccagggatgggg36<210>6<211>36<212>dna<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1)..(36)<223><400>6ccccatccctgggtagtatcatagctaaagatacca36<210>7<211>325<212>dna<213>山羊<220><221>gene<222>(1)..(325)<223><400>7agtggtttcctcctgcccttcaggcttctaggaagtggcgccagctggggtgagatcact60tcctcagccgcctgcccgccaccccctcagcttcctctccccatggccccatttagcctg120cccagggctccgtgctgcgggcggggcgggggtgggggtgggggctcggccaaggaatgg180agtgggtgctggctctgggagttcctacagcctccttggccgaaagtgactctgtgggta240tctctacttctctgggtctgggaagcctggctgggggtgtccagcctggtggtatcttta300gctatgatactacccagggatgggg325<210>8<211>389<212>dna<213>山羊<220><221>gene<222>(1)..(389)<223><400>8tggtatctttagctatgatactacccagggatgggggagcctggagggctgccgtctatg60gggtcgcacagagtcggacacgactgaagcgacttagccgcagcagcagcacatgcggaa120ggccttcccgggtggcgctagtggtaaagagcccgcctgccaacgcaggagacaagagaa180cgagggttcgatccctgggtggcgaagattccctggaggagggcatggcaacccactcca240gtattcttgcctggagaatcccatggacaggggagcctgatgggctatagtccgtggggt300cgcaagagtcagacacgactgaagcgacggcacggacgcacatggggaaagcggcttctc360tgcgagacctcaaaggatggcggcaaggg389<210>9<211>678<212>dna<213>山羊<220><221>gene<222>(1)..(678)<223><400>9agtggtttcctcctgcccttcaggcttctaggaagtggcgccagctggggtgagatcact60tcctcagccgcctgcccgccaccccctcagcttcctctccccatggccccatttagcctg120cccagggctccgtgctgcgggcggggcgggggtgggggtgggggctcggccaaggaatgg180agtgggtgctggctctgggagttcctacagcctccttggccgaaagtgactctgtgggta240tctctacttctctgggtctgggaagcctggctgggggtgtccagcctggtggtatcttta300gctatgatactacccagggatgggggagcctggagggctgccgtctatggggtcgcacag360agtcggacacgactgaagcgacttagccgcagcagcagcacatgcggaaggccttcccgg420gtggcgctagtggtaaagagcccgcctgccaacgcaggagacaagagaacgagggttcga480tccctgggtggcgaagattccctggaggagggcatggcaacccactccagtattcttgcc540tggagaatcccatggacaggggagcctgatgggctatagtccgtggggtcgcaagagtca600gacacgactgaagcgacggcacggacgcacatggggaaagcggcttctctgcgagacctc660aaaggatggcggcaaggg678当前第1页12