本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种玫烟色棒束孢的发酵培养方法。
背景技术：
玫烟色棒束孢(Isaria fumosaroseus)是一类广泛侵染多种昆虫的病原真菌，对柑橘木虱有很强的侵染作用，是柑橘木虱生物防治的优良菌种。玫烟色棒束孢的经济、快速、大规模生产是其大量用于生物防治实践的前提，单独使用液体发酵产生的繁殖体不耐储藏，目前玫烟色棒束孢发酵的方法较复杂，成本较高，培养过程中很容易出现杂菌污染现象。因此，研发新的高效、低成本大规模化生产培养基及操作简单、不易污染的培养方法，是玫烟色棒束孢发酵生产的关键问题。
技术实现要素：
本发明涉及一种对柑橘木虱高效的病原真菌玫烟色棒束孢(Isaria fumosaroseus)的液体-固体发酵培养基及其培养方法。
本发明提供的发酵培养方法包括以下步骤：
1)液体发酵阶段：以100ml液体培养基计，接种玫烟色棒束孢的孢子悬浮液1-8ml，于20-29℃，转速100-200r/min条件下培养1-3天，得菌丝液；
2)固体发酵阶段：将菌丝液接种于固体培养基中，菌丝液的体积占固体培养基重量的4-12％，置于15-35℃下培养6-18天后收获，
所述液体培养基含碳源为10-30g/L，含氮源为5-25g/L，含微量元素为50-250mg/L，含基础盐为0.5-1.5g/L，pH值为4-8；
所述固体培养基为玉米粉、大米、花生饼粉、麦麸、豆粕中的一种或一种以上任意组合，加水至含水量为40-80％，pH值为4-8。
优选地，所述碳源为蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、玉米粉浸出液和麦麸浸出液中的一种或一种以上任意组合。
优选地，所含氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、豆粕粉、(NH4)2SO4、NH4Cl中的一种或一种以上任意组合。
优选地，所述微量元素为镁盐、铜盐、锌盐、铁盐中的一种或一种以上任意组合。
本发明的有益效果是：
本发明采用液体-固体双相发酵方法生产玫烟色棒束孢的分生孢子，孢子产量、纯度和活孢率都非常高，全部发酵培养周期在20天左右，具有生产周期短、成本低、效率高等优点，适用于玫烟色棒束孢的大规模生产。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进一步详细说明。
实施例1
1)液体发酵阶段：以100ml液体培养基计，接种玫烟色棒束孢的孢子悬浮液3.6ml(每ml含1.0×107个孢子)，于26℃，转速125r/min条件下培养3天，得菌丝液；
2)固体发酵阶段：将菌丝液接种于固体培养基中，菌丝液的体积(ml)占固体培养基重量(g)的10％，置于25℃培养15天后收获。
所述液体培养基含碳源(葡萄糖)为25g/L，含氮源(酵母粉)为25g/L，含微量元素(硫酸铜、硫酸锌、硫酸镁，重量为1:1:1)为150mg/L，含基础盐(磷酸氢二钾、氯化钾，重量为1:1)为1g/L，pH值为6。高压湿热灭菌30min，冷却后备用。
所述固体培养基为玉米粉300g，加水700g，混匀，pH值为5。高压湿热灭菌30min，冷却后备用。
将收获的孢子粉进行烘干测量，每500g干基质产孢子粉8.39g，每g孢子粉含孢子1.61×1011个，达1000亿个以上，活孢率达到92.34％。
实施例2
1)液体发酵阶段：以100ml液体培养基计，接种玫烟色棒束孢的孢子悬浮液1ml，于20℃，转速200r/min条件下培养1天，得菌丝液；
2)固体发酵阶段：将菌丝液接种于固体培养基中，菌丝液的体积(ml)占固体培养基重量(g)的4％，置于15℃培养18天后收获。
所述液体培养基含碳源(蔗糖、玉米粉浸出液，重量为3:1)为10g/L，含氮源(蛋白胨、NH4Cl，重量为4:1)为5g/L，含微量元素(硫酸铜)为50mg/L，含基础盐(氯化钠)为0.5g/L，pH值为8。
所述固体培养基为花生饼粉600g，加水400g，混匀，pH值为8。
将收获的孢子粉进行烘干测量，每500g干基质产孢子粉6.86g，每g孢子粉含孢子9.72×1010个，活孢率达到89.35％。
实施例3
1)液体发酵阶段：以100ml液体培养基计，接种玫烟色棒束孢的孢子悬浮液8ml，于29℃，转速100r/min条件下培养2天，得菌丝液；
2)固体发酵阶段：将菌丝液接种于固体培养基中，菌丝液的体积(ml)占固体培养基重量(g)的12％，置于35℃培养8天后收获。
所述液体培养基含碳源(麦芽糖、麦麸浸出液，重量为5:1)为30g/L，含氮源(蛋白胨、酵母粉，重量为1:1)为25g/L，含微量元素(硫酸锌)为250mg/L，含基础盐(氯化钠、氯化钾，重量为2:1)为1.5g/L，pH值为4。
所述固体培养基为麦麸、豆粕各100g，加水800g，混匀，pH值为8。
将收获的孢子粉进行烘干测量，每500g干基质产孢子粉7.28g，每g孢子粉含孢子6.59×1010个，活孢率达到87.77％。
实施例4
1)液体发酵阶段：以100ml液体培养基计，接种玫烟色棒束孢的孢子悬浮液5.4ml，于24℃，转速160r/min条件下培养2天，得菌丝液；
2)固体发酵阶段：将菌丝液接种于固体培养基中，菌丝液的体积(ml)占固体培养基重量(g)的8％，置于30℃培养14天后收获。
所述液体培养基含碳源(蔗糖)为15g/L，含氮源(牛肉膏)为20g/L，含微量元素(硫酸铜、硫酸锌、硫酸镁、硫酸铁，重量为1:1:1：1)为200mg/L，含基础盐(磷酸氢二钾、氯化钾，重量为1:1)为1.2g/L，pH值为7。
所述固体培养基为花生饼粉400g，加水600g，混匀，pH值为7。
将收获的孢子粉进行烘干测量，每500g干基质产孢子粉8.07g，每g孢子粉含孢子1.18×1011个，活孢率达到90.65％。