本发明属于生物质能源技术领域，特别涉及一种利用低聚物絮凝微藻的方法及其应用。
背景技术：
微藻(Microalga)是一种独特的可自养的最原始的生物之一，是可以将太阳能直接转化为化学能的光合生物。微藻体积小，结构简单，具有种类多，分布广，适应环境能力强，生长周期短，生长速率快，含油量高等优点。
微藻是一种经济、高效的可再生的生物质能源，相比于其它油料作物，微藻不需占用耕地资源，不与农业竞争，不会造成粮食危机。其最大的优势是能累积高含量的油脂，约占微藻细胞干重的15～80％。在生物能源领域占有重要地位。但目前通过微藻获取生物柴油的生产成本很高，相对于传统的化石能源，其在价格上缺乏竞争力，所以能源微藻作为生物质能源一直没有得到推广利用。因此，对能源微藻制备生物柴油过程中的各个环节进行成本压缩尤为重要。而采收作为其中一个重要的环节约占总成本的20～30％，这是由于微藻个体微小(3～30μm)，浓度低，细胞易损伤而破裂，且细胞表面多带负电荷，细胞稳定悬浮于培养液中。特别是在其生长后期，随着油脂含量的不断积累，密度越小越不易沉降，这给采收工作带来很大挑战。因此，寻求一种高效、低廉的微藻细胞采收途径是实现微藻产业化亟待解决的问题之一。
目前，微藻采收的方法有很多种，传统的采收方法有离心法、过滤法、气浮法、重力沉降法和絮凝法。其中，应用最为普遍的是离心法，离心法对微藻个体要求不高，在合适的条件下微藻分离效率可以达到95％，其主要用于高附加值藻类的采收以及在初步分离后进一步脱水。离心法可以极大程度保留细胞原有化学性质，但由于很多微藻细胞无细胞壁，在强大的离心力和剪切力下，微藻的细胞结构会遭到破坏。
过滤的基本原理是：悬浮液在离心力或压强差的作用下通过多孔滤膜，液相从孔隙流过滤膜，固相留在滤膜上形成滤饼，从而达到固液分离的过程，是微藻采收的常用方法之一。过滤主要用于体积较大形体较均匀的微藻的采收，但过滤过程中由于造成膜污染或易破损，给膜清洗和再次利用带来困难，所以，目前过滤技术在能源微藻的大规模采收方面应用较少。
气浮又称为浮选，基本原理是：在固液悬浮液中通入微气泡，形成固、液、气三相混合流，固体颗粒与微气泡粘附形成共聚体，在浮力作用下，使共聚体上浮，从而达到固液分离。气浮法是一种高效分离的固液分离技术，在水处理及选矿方面应用较多。气浮法主要包括分散空气气浮法、压力溶气气浮法、电解气浮和生物及化学气浮等几种形式，由于气浮法简单、方便、采收效率高、可连续操作、对细胞损伤小等优点，在微藻细胞采收方面具有较大的发展潜能，但气浮法也易受诸多因素影响，如：气泡尺寸、细胞表面性质、溶液化学条件及气浮环境等。
絮凝法是通过加入少量的絮凝剂，利用微藻细胞与絮凝剂之间的各种作用力，而达到初分离效果的方法，是被认为最具经济性的采收方法，可适用于大规模的微藻采收，且对藻种的适用范围较广，能耗低。
微藻细胞的絮凝根据不同的作用机理可以分为细胞自发絮凝、电解絮凝和化学絮凝。细胞自发絮凝是通过改变培养液的pH值，诱导细胞自发絮凝的一种现象。电解絮凝是通过引入电极(Al和Fe等)，电解微藻溶液，阳极电解产生金属阳离子(Al3+和Fe3+)，由于吸附电中和等作用使微藻絮凝，同时在电解过程中产生氧气和氢气与絮体吸附，从而上浮，加快微藻采收效率。电解絮凝法不用另外加絮凝剂，采收后不会残留硫酸根离子和氯离子等阴离子，具有絮凝效率高，适用pH值范围广，可适用大多数藻类，集气浮絮凝于一体等优点，但由于能耗大，暂未用于微藻的大规模采收。化学絮凝是根据微藻细胞表面带负电荷等特性，通过加入阳离子电解质对微藻细胞表面电荷进行中和，从而减小细胞间斥力，最后使其彼此靠拢而聚集的过程。常用的化学絮凝剂主要有无机絮凝剂、高分子絮凝剂和生物絮凝剂。其中无机絮凝剂Fe3+、Mg2+、Al3+、Zn2+等由于电中和等作用，使微藻细胞表面的负电性减弱，从而使微藻絮凝。Papazi等通过研究铝、铁、锌三种金属盐采收小球藻的絮凝效果时发现，铝盐的絮凝效果最好，但可能导致细胞溶解；铁盐次之，锌盐对细胞的损害最小，但微藻细胞容易粘在容器的边缘。同时，金属盐还可以通过形成聚合体，以吸附、架桥等方式形成聚合体从而引发絮凝，除此以外，金属盐还可以通过形成沉淀物，以网捕卷扫的作用促进微藻的絮凝。高分子絮凝剂主要通过加入聚丙烯酰胺、壳聚糖、阳离子淀粉等，根据吸附架桥、吸附电中和、网捕卷扫等作用使多个细胞聚集桥接，形成较大的絮团，有利于后续脱水的处理，且具有非常好的采收效果和实用意义。
然而，无机絮凝剂会影响能源微藻的后续生产，而高分子絮凝剂的使用成本较高，难降解，容易产生污染，限制其大规模的应用。为避免污染，Benemann和Oswald提出采用微生物絮凝剂，但微生物絮凝剂成本高，且培养基的循环使用也受残留微生物剂量的影响。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种利用低聚物絮凝微藻的方法。
本发明方法利用低聚物絮凝微藻，通过往待采收藻液中投加含氨基质子化基团的低聚物，利用低聚物带质子化的氨基中和微藻表面的负电荷和低聚物的空间结构架桥微藻，消除微藻细胞间的相互排斥力，并使多个细胞聚集相互桥接，从而达到微藻絮凝、聚合沉降分离的目的。该方法操作简单，分离效率高，更重要的是补充了低聚物絮凝微藻的空缺。
本发明另一目的在于提供上述利用低聚物絮凝微藻的方法在分离采收微藻中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种利用低聚物絮凝微藻的方法，包括以下具体步骤：
向培养有微藻的培养液中加入低聚物，搅拌使微藻絮凝沉降，静置分层后，分离上层清液，得到絮凝后的培养液和微藻。
所述的低聚物指氨基硅烷偶联剂醇溶液水解得到的混合低聚物。
所述的氨基硅烷偶联剂指氨丙基三甲氧基硅烷和氨丙基三乙氧基硅烷中的至少一种。
所述氨基硅烷偶联剂醇溶液中氨基硅烷偶联剂的浓度优选为3～10v/v％。
所述氨基硅烷偶联剂醇溶液中氨基硅烷偶联剂的浓度更优选为3v/v％。
所述的氨基硅烷偶联剂醇溶液优选以无色乙醇为溶剂。
所述的水解优选为在酸性溶液催化下进行。
所述酸性溶液优选为硫酸溶液，更优选为通过浓硫酸和水以体积比3:1混合得到的硫酸溶液。
所述酸性溶液作为催化剂，其用量为催化量即可，优选与氨基硅烷偶联剂醇溶液的体积比为1:200～1:400，更优选为1:300。
所述的低聚物具体可由包括以下步骤方法得到：将氨基硅烷偶联剂乙醇溶液在酸性溶液催化下水解，得到混合低聚物。
所述水解结束后可通过离心并醇洗，洗去酸液等，得到混合低聚物。
所述培养有微藻的培养液中微藻含量优选为0.5～6.5g·L-1。
所述微藻指能源微藻。
本发明方法通过絮凝沉降的方法达到微藻分离，微藻浓度过低不利于细胞团聚，微藻浓度越高越有利于提高絮凝采收效果。
本发明方法中，通过加入低聚物混合物，优选使用氨基硅烷偶联剂水解得到的低聚体混合物，至体系中出现明显团聚絮体即可分离。
上述低聚物絮凝微藻的方法在采收微藻中的应用。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
本发明通过往微藻培养液中加入低聚物，通过低聚物中的质子化氨基与微藻细胞表面由于羟基或硫酸根等集团而带的负电荷发生作用，达到消除细胞间表面斥力的效果，打破微藻在培养液中的平衡状态，同时，由于低聚物的空间位阻作用，使微藻细胞相互桥接而发生团聚沉降，从而达到絮凝采收的效果，采收效率可达90％以上。
附图说明
图1为实施例1的微藻絮凝分离前后细胞形态的光学显微镜图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中使用的试剂均可从商业渠道获得。
实施例1：Scenedesmus sp的絮凝分离
(1)低聚物的制备
步骤一：取5mL蒸馏水于50mL的烧杯中，缓慢加入15mL的浓硫酸(分析纯)，静置冷却至室温，待用。
步骤二：取291mL无水乙醇于500mL的干净烧杯中，然后加入9mL的三氨基三甲氧基硅烷，搅拌1min后即可。
步骤三：取步骤一中溶液1mL于步骤二溶液中，搅拌1min，静置21.5h，离心，用无水乙醇冲洗三次，然后在真空干燥箱80℃下干燥12h，即得低聚物混合物。对其进行表征，结果如下：
29SiNMR(119MHz,D2O):δ-68.67,-58.94,-48.97；
1HNMR(300MHz,D2O,25℃):δ3.54(q,nH),δ2.91(t,6nH),δ1.69(d,6nH),δ1.07(t,1.5nH),δ0.62(t,6nH)；
13CNMR(75MHZ,D2O,25℃):δ57.42,41.71,20.62,16.79,8.67；
FTIR(KBr,cm-1):υ(Si-OH)3419.9(br),υ(Si-O-Si)1127.4(br),δas(NH3+)1603.7,δ(NH3+)1498.8。
由ESI-HRMS表征可知，其分子量不超过1000，并结合上述表征表明水解获得低聚物混合物。
(2)微藻的分离
在光生物反应器中采用常规的BG-11培养液培养sp栅藻(Scenedesmus sp，购买于美国德克萨斯大学奥斯汀分校藻种保藏中心)。量取2L的BG-11培养液进行培养，微藻植入量调节为OD750≈0.6，在温度为室温下，平均光强为200μmol·m-2·s-1冷白的日光灯照24h，并连续通入含有1％CO2(v/v)的空气。培养时间一周期为16天。
当培养液中Scenedesmus sp干重为6.46g/L，将制备好的低聚物混合物取20～80mg/L加入微藻培养液中，在转速为300rpm下搅拌1min，静置分层，倒出上层清液，即得到Scenedesmus sp。分离率按照以下公式计算：
分离率(％)＝(1-A)/B×100％
式中A为絮凝分离后上清液在OD750下测得的吸光度，B是分离前的培养液在OD750下测得的吸光度。通过以上公式计算静置15min后的分离率为80.46～97.56％。
往分离后到出的培养液中加入BG-11培养液，即可循环用于培养微藻。
实施例2：细胞活性观察
使用伊文思蓝溶液染色法测定实例1中Scenedesmus sp的絮凝前后的细胞活性(见图1)。具体操作如下：取实例1微藻絮凝后1mL微藻液，离心后去除上清液，然后往离心后的微藻加入100μL 1wt％伊文思蓝溶液，并在室温下培养3h。然后用蒸馏水洗涤两遍去除过多以及已释放的染料。接着把洗涤好的微藻用光学显微镜观察并拍照。由于伊文思蓝溶液会扩散进入到已破坏微藻的原生质中，使其染上颜色，所以已收到破坏而溶解的微藻会由绿色变成蓝色，而完好的细胞则依然保持原有的绿色。
其中图1中：絮凝前的微藻细胞(a)；温度为121℃受热后微藻细胞(b)；絮凝后微藻细胞(c)；
由图1可知，与絮凝前相比，本发明方法絮凝后得到的微藻基本没有受到损坏，细胞完整。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。