本发明涉及一种去甲基金霉素的提取方法。
背景技术：
：去甲基金霉素(英文名称Demethylchlortetracycline，缩写DMCTC，其结构如式1所示)具有较宽的抗菌谱，对革兰阳性菌包括耐四环素的金黄色葡萄球菌、链球菌等和革兰阴性菌中的淋病耐瑟菌均有很强的作用，是生产米洛环素和替加环素关键前体，是一种重要的医药原料。去甲基金霉素由金黄色链霉菌(Streptomycesaureus)发酵生产，然后通过分离提取得到原料药去甲基金霉素盐，目前主要报道的分离提取的工艺主要有：(1)发酵液经过酸化、萃取、反萃取、浓缩结晶方法(中国抗生素杂志，2000，25：341-343)，其缺点是使用了大量的有机溶媒，污染大；(2)利用柱层析纯化法提取去甲基金霉素(中国抗生素杂志，2013，38：915-917)，其缺点是生产成本高，不适用于工业化大生产；(3)发酵液调至碱性pH，加入晶种结晶的方法(CN201310575459)。虽然操作简单，但由于去甲基金霉素在碱性条件下稳定性差，容易形成DMCTC差向异构体；(4)将浓缩脱色的发酵液调节pH在4.5-8.5，结晶沉淀，然后利用去甲基金霉素复盐法精制(CN201310380480)。但分离过程需要利用树脂对发酵液脱色减少杂质，增加了操作成本。DMCTC的价格便宜、用量大，应用中对其纯度有较高的要求，现有的工艺制得的DMCTC的纯度无法达到94％以上，因此，会限制其大规模生产应用，因此开发一种污染小、成本低、简单可行的生产工艺以使DMCTC的纯度达到94％以上，甚至达到USP质量要求(纯度≥95％)是目前亟须解决的问题。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中有机溶媒使用量大、生产成本高等缺陷，而提供一种污染小、成本低的去甲基金霉素的提取方法。本发明提供了一种去甲基金霉素的提取方法，其包括如下步骤：(1)调含去甲基金霉素的发酵液的pH值至酸性，所述发酵液与菌体进行固液分离，得液体1；(2)所得液体1与3-4％的阳离子表面活性剂，在pH值为8.0-8.5，发生络合反应，固液分离，得络合物1；所述阳离子表面活性剂为十四烷基三甲基氯化铵和/或十六烷基三甲基氯化铵；所述百分比为所述阳离子表面活性剂的质量占所述液体1的质量的百分比；(3)调所得络合物1的pH值，并与尿素发生络合反应，固液分离，得络合物2；(4)调所得络合物2的pH值，所得络合物2溶解，固液分离，得液体2；(5)用盐酸调节所得液体2的pH值至酸性，降温、结晶，得DMCTC盐酸盐。本发明中，所说的含去甲基金霉素的发酵液为本领域常规所说的由金黄色链霉菌(Streptomycesaureus)发酵生产得到的发酵液，其中含有去甲基金霉素。步骤(1)中，所述调发酵液的pH值的操作为本领域常规，所述pH值较佳地调至1.0-2.0，所述pH值更佳地调至1.5。所述调pH值的物质为本领域常规pH调节剂，如硫酸水溶液。步骤(1)中，所述的固液分离为本领域常规，较佳地为微滤，所述微滤采用的微滤膜为本领域常规，较佳地为0.45μm陶瓷膜。步骤(2)中，所述十四烷基三甲基氯化铵为本领域常规，较佳地为PurumTTAC150，所述十六烷基三甲基氯化铵为本领域常规，较佳地为PurumCTAC150，所述PurumTTAC150和PurumCTAC150购于韩国idchem有限公司。步骤(2)中，所述调pH值的物质为本领域常规pH调节剂，如氢氧化钠水溶液。步骤(2)中，所述的固液分离为本领域常规，一般为过滤。步骤(3)中，所述调所得络合物1的pH值的操作为本领域常规，所述pH值较佳地调至1.0-2.0，所述pH值更佳地调至1.5。所述调pH值的物质为本领域常规pH调节剂，如硫酸水溶液。步骤(3)中，所述的固液分离为本领域常规，一般为过滤。步骤(4)中，所述调所得络合物2的pH值的操作为本领域常规，所述pH值较佳地调至2.0-3.0，所述pH值更佳地调至2.5。所述调pH值的物质为本领域常规pH调节剂，如氢氧化钠水溶液。步骤(4)中，所述的固液分离为本领域常规，一般为过滤。步骤(5)中，所述调节所得液体2的pH值的操作为本领域常规，所述pH值较佳地调至0.2-0.8，所述pH值更佳地调至0.5。步骤(5)中，所述降温的操作为本领域常规，所述降温较佳地降温至5℃；所述结晶的操作为本领域常规，所述结晶的时间较佳地为6小时。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：本发明去甲基金霉素的提取方法，通过对阳离子表面活性剂的种类、用量及加入阳离子表面活性剂之后pH值的创造性发现，可获得纯度≥94％的DMCTC盐酸盐，甚至达到USP质量要求(纯度≥95％)。附图说明图1为本发明实施例1中去甲基金霉素发酵液的HPLC图谱。图2为本发明实施例1中获得的去甲基金霉素盐酸盐的HPLC图谱。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。金黄色链霉菌(Streptomycesaureus)ATCC21658购于美国模式培养物集存库(ATCC)。下述实施例中的含去甲基金霉素的发酵液的制备方法如下：将金黄色链霉菌(Streptomycesaureus)ATCC21658的菌丝接种到种子培养基，在培养温度为28℃下，培养40小时后，按10％接种量接种到发酵培养基，在培养温度28℃下，培养7-8天，收集含去甲基金霉素的发酵液，用于下一步的分离纯化。种子培养基(g/L)：可溶性淀粉2.0，葡萄糖1.5，黄豆饼粉1.5，氯化钠0.3；发酵培养基(g/L):可溶性淀粉5.0，麦芽糊精2.0，葡萄糖1.0，黄豆饼粉3.0，干酵母粉5.0，豆油2.0，CaCO30.3。下述实施例中的阳离子表面活性剂PurumTTAC150和PurumCTAC150购于韩国idchem有限公司。DMCTCHPLC分析方法如下：分析定柱：ODSC18柱，4.6×250mm，5um；柱温：40℃；流动相A相为0.02mol/L的磷酸二氢钾(0.1％磷酸)水溶液:乙腈＝90：10(V/V)，B相为0.02mol/L的磷酸二氢钾(0.1％磷酸)水溶液:乙腈＝70：30(V/V)；流速为1.0mL/min；检测器波长254nm；进样量10uL，运行时间为20min。梯度洗脱表：时间(min)A相(％)B相(％)010005100080100180100231000301000实施例1含去甲基金霉素的发酵液，其图谱如图1所示，发酵单位为3250mg/L，体积为1000mL，用硫酸水溶液调节pH值至1.5，搅拌30分钟，经过0.45μm陶瓷膜过滤，收集滤液。加入3.0％PurumTTAC150，然后用NaOH水溶液调节pH值至8.5，板框过滤，收集滤饼。经过水洗涤后，用硫酸水溶液调节pH值到1.5，加入尿素并维持pH值为1.5，过滤，收集滤饼。用NaOH水溶液调pH至2.5，搅拌，过滤，收集滤液。向滤液加入盐酸至pH值为0.5，搅拌，降温至5℃，结晶6小时，过滤，收集滤饼，60℃干燥8小时得DMCTC盐酸盐，其图谱如图2所示，13min左右出峰，总收率74％，纯度为95.5％。实施例2将含去甲基金霉素的发酵液，发酵单位为3250mg/L，体积为1000mL，用硫酸水溶液调节pH值至1.5，搅拌30分钟，经过0.45μm陶瓷膜过滤，收集滤液。加入3.5％PurumTTAC150，然后用NaOH水溶液调节pH值至8.5，板框过滤，收集滤饼。经过水洗涤后，用硫酸水溶液调节pH值到1.5，加入尿素并维持pH值为1.5，过滤，收集滤饼。用NaOH水溶液调pH至2.5，搅拌，过滤，收集滤液。向滤液加入盐酸至pH值为0.5，搅拌，降温至5℃，结晶6小时，过滤，收集滤饼，60℃干燥8小时得DMCTC盐酸盐，总收率74.5％，纯度为95.4％。实施例3将含去甲基金霉素的发酵液，发酵单位为3250mg/L，体积为1000mL，用硫酸水溶液调节pH值至1.5，搅拌30分钟，经过0.45μm陶瓷膜过滤，收集滤液。加入4.0％PurumTTAC150，然后用NaOH水溶液调节pH值至8.5，板框过滤，收集滤饼。经过水洗涤后，用硫酸水溶液调节pH值到1.5，加入尿素并维持pH值为1.5，过滤，收集滤饼。用NaOH水溶液调pH至2.5，搅拌，过滤，收集滤液。向滤液加入盐酸至pH值为0.5，搅拌，降温至5℃，结晶6小时，过滤，收集滤饼，60℃干燥8小时得DMCTC盐酸盐，总收率75.1％，纯度为95.2％。对比例1将含去甲基金霉素的发酵液，发酵单位为3250mg/L，体积为1000mL，用硫酸水溶液调节pH值至1.5，搅拌30分钟，经过0.45μm陶瓷膜过滤，收集滤液。加入2.5％PurumTTAC150，然后用NaOH水溶液调节pH值至8.5，板框过滤，收集滤饼。经过水洗涤后，用硫酸水溶液调节pH值到1.5，加入尿素并维持pH值为1.5，过滤，收集滤饼。用NaOH水溶液调pH至2.5，搅拌，过滤，收集滤液。向滤液加入盐酸至pH值为0.5，搅拌，降温至5℃，结晶6小时，过滤，收集滤饼，60℃干燥8小时得DMCTC盐酸盐，总收率63％，纯度为93.2％。对比例2将含去甲基金霉素的发酵液，发酵单位为3250mg/L，体积为1000mL，用硫酸水溶液调节pH值至1.5，搅拌30分钟，经过0.45μm陶瓷膜过滤，收集滤液。加入4.5％PurumTTAC150，然后用NaOH水溶液调节pH值至8.5，板框过滤，收集滤饼。经过水洗涤后，用硫酸水溶液调节pH值到1.5，加入尿素并维持pH值为1.5，过滤，收集滤饼。用NaOH水溶液调pH至2.5，搅拌，过滤，收集滤液。向滤液加入盐酸至pH值为0.5，搅拌，降温至5℃，结晶6小时，过滤，收集滤饼，60℃干燥8小时得DMCTC盐酸盐，总收率68％，纯度为94.3％。项目DMCTC的总收率/％DMCTC的纯度/％实施例17495.5实施例274.595.4实施例375.195.2对比例16393.2对比例26894.3实施例4将含去甲基金霉素的发酵液，发酵单位为3200mg/L，体积为1000mL，用硫酸水溶液调节pH值至1.5，搅拌30分钟，经过0.45μm陶瓷膜过滤，收集滤液。加入3.0％PurumCTAC150，然后用NaOH水溶液调节pH值至8.5，板框过滤，收集滤饼。经过水洗涤后，用硫酸水溶液调节pH值到1.5，加入尿素并维持pH值为1.5，过滤，收集滤饼。用NaOH水溶液调pH至2.5，搅拌，过滤，收集滤液。向滤液加入盐酸至pH值为0.5，搅拌，降温至5℃，结晶6小时，过滤，收集滤饼，60℃干燥8小时得DMCTC盐酸盐，总收率60.2％，纯度为94.2％。实施例5将含去甲基金霉素的发酵液，发酵单位为3200mg/L，体积为1000mL，用硫酸水溶液调节pH值至1.5，搅拌30分钟，经过0.45μm陶瓷膜过滤，收集滤液。加入3.5％PurumCTAC150，然后用NaOH水溶液调节pH值至8.5，板框过滤，收集滤饼。经过水洗涤后，用硫酸水溶液调节pH值到1.5，加入尿素并维持pH值为1.5，过滤，收集滤饼。用NaOH水溶液调pH至2.5，搅拌，过滤，收集滤液。向滤液加入盐酸至pH值为0.5，搅拌，降温至5℃，结晶6小时，过滤，收集滤饼，60℃干燥8小时得DMCTC盐酸盐，总收率63％，纯度为94.6％。实施例6将含去甲基金霉素的发酵液，发酵单位为3200mg/L，体积为1000mL，用硫酸水溶液调节pH值至1.5，搅拌30分钟，经过0.45μm陶瓷膜过滤，收集滤液。加入4.0％PurumCTAC150，然后用NaOH水溶液调节pH值至8.5，板框过滤，收集滤饼。经过水洗涤后，用硫酸水溶液调节pH值到1.5，加入尿素并维持pH值为1.5，过滤，收集滤饼。用NaOH水溶液调pH至2.5，搅拌，过滤，收集滤液。向滤液加入盐酸至pH值为0.5，搅拌，降温至5℃，结晶6小时，过滤，收集滤饼，60℃干燥8小时得DMCTC盐酸盐，总收率62％，纯度为94.2％。对比例3将含去甲基金霉素的发酵液，发酵单位为3200mg/L，体积为1000mL，用硫酸水溶液调节pH值至1.5，搅拌30分钟，经过0.45μm陶瓷膜过滤，收集滤液。加入2.5％PurumCTAC150，然后用NaOH水溶液调节pH值至8.5，板框过滤，收集滤饼。经过水洗涤后，用硫酸水溶液调节pH值到1.5，加入尿素并维持pH值为1.5，过滤，收集滤饼。用NaOH水溶液调pH至2.5，搅拌，过滤，收集滤液。向滤液加入盐酸至pH值为0.5，搅拌，降温至5℃，结晶6小时，过滤，收集滤饼，60℃干燥8小时得DMCTC盐酸盐，总收率59％，纯度为91.1％。对比例4将含去甲基金霉素的发酵液，发酵单位为3200mg/L，体积为1000mL，用硫酸水溶液调节pH值至1.5，搅拌30分钟，经过0.45μm陶瓷膜过滤，收集滤液。加入4.5％PurumCTAC150，然后用NaOH水溶液调节pH值至8.5，板框过滤，收集滤饼。经过水洗涤后，用硫酸水溶液调节pH值到1.5，加入尿素并维持pH值为1.5，过滤，收集滤饼。用NaOH水溶液调pH至2.5，搅拌，过滤，收集滤液。向滤液加入盐酸至pH值为0.5，搅拌，降温至5℃，结晶6小时，过滤，收集滤饼，60℃干燥8小时得DMCTC盐酸盐，总收率60％，纯度为92.8％。项目DMCTC的总收率/％DMCTC的纯度/％实施例460.294.2实施例56394.6实施例66294.2对比例35991.1对比例46092.8实施例7将含去甲基金霉素的发酵液，发酵单位为3500mg/L，体积为1000mL，用硫酸水溶液调节pH值至1.5，搅拌30分钟，经过0.45μm陶瓷膜过滤，收集滤液。加入3.0％PurumTTAC150，然后用NaOH水溶液调节pH值至8.0，板框过滤，收集滤饼。经过水洗涤后，用硫酸水溶液调节pH值到1.5，加入尿素并维持pH值为1.5，过滤，收集滤饼。用NaOH水溶液调pH至2.5，搅拌，过滤，收集滤液。向滤液加入盐酸至pH值为0.5，搅拌，降温至5℃，结晶6小时，过滤，收集滤饼，60℃干燥8小时得DMCTC盐酸盐，总收率73％，纯度为95.8％。实施例8将含去甲基金霉素的发酵液，发酵单位为3500mg/L，体积为1000mL，用硫酸水溶液调节pH值至1.5，搅拌30分钟，经过0.45μm陶瓷膜过滤，收集滤液。加入3.0％PurumTTAC150，然后用NaOH水溶液调节pH值至8.5，板框过滤，收集滤饼。经过水洗涤后，用硫酸水溶液调节pH值到1.5，加入尿素并维持pH值为1.5，过滤，收集滤饼。用NaOH水溶液调pH至2.5，搅拌，过滤，收集滤液。向滤液加入盐酸至pH值为0.5，搅拌，降温至5℃，结晶6小时，过滤，收集滤饼，60℃干燥8小时得DMCTC盐酸盐，总收率74％，纯度为95.5％。对比例5将含去甲基金霉素的发酵液，发酵单位为3500mg/L，体积为1000mL，用硫酸水溶液调节pH值至1.5，搅拌30分钟，经过0.45μm陶瓷膜过滤，收集滤液。加入3.0％PurumTTAC150，然后用NaOH水溶液调节pH值至7.5，板框过滤，收集滤饼。经过水洗涤后，用硫酸水溶液调节pH值到1.5，加入尿素并维持pH值为1.5，过滤，收集滤饼。用NaOH水溶液调pH至2.5，搅拌，过滤，收集滤液。向滤液加入盐酸至pH值为0.5，搅拌，降温至5℃，结晶6小时，过滤，收集滤饼，60℃干燥8小时得DMCTC盐酸盐，总收率40％，纯度为93.3％。对比例6将含去甲基金霉素的发酵液，发酵单位为3500mg/L，体积为1000mL，用硫酸水溶液调节pH值至1.5，搅拌30分钟，经过0.45μm陶瓷膜过滤，收集滤液。加入3.0％PurumTTAC150，然后用NaOH水溶液调节pH值至9.0，板框过滤，收集滤饼。经过水洗涤后，用硫酸水溶液调节pH值到1.5，加入尿素并维持pH值为1.5，过滤，收集滤饼。用NaOH水溶液调pH至2.5，搅拌，过滤，收集滤液。向滤液加入盐酸至pH值为0.5，搅拌，降温至5℃，结晶6小时，过滤，收集滤饼，60℃干燥8小时得DMCTC盐酸盐，总收率61％，纯度为92.4％。项目DMCTC的总收率/％DMCTC的纯度/％实施例77395.8实施例87495.5对比例54093.3对比例66192.4实施例9将含去甲基金霉素的发酵液，发酵单位为3230mg/L，体积为1000mL，用硫酸水溶液调节pH值至1.5，搅拌30分钟，经过0.45μm陶瓷膜过滤，收集滤液。加入3.0％PurumCTAC150，然后用NaOH水溶液调节pH值至8.0，板框过滤，收集滤饼。经过水洗涤后，用硫酸水溶液调节pH值到1.5，加入尿素并维持pH值为1.5，过滤，收集滤饼。用NaOH水溶液调pH至2.5，搅拌，过滤，收集滤液。向滤液加入盐酸至pH值为0.5，搅拌，降温至5℃，结晶6小时，过滤，收集滤饼，60℃干燥8小时得DMCTC盐酸盐，总收率58％，纯度为94.2％。实施例10将含去甲基金霉素的发酵液，发酵单位为3230mg/L，体积为1000mL，用硫酸水溶液调节pH值至1.5，搅拌30分钟，经过0.45μm陶瓷膜过滤，收集滤液。加入3.0％PurumCTAC150，然后用NaOH水溶液调节pH值至8.5，板框过滤，收集滤饼。经过水洗涤后，用硫酸水溶液调节pH值到1.5，加入尿素并维持pH值为1.5，过滤，收集滤饼。用NaOH水溶液调pH至2.5，搅拌，过滤，收集滤液。向滤液加入盐酸至pH值为0.5，搅拌，降温至5℃，结晶6小时，过滤，收集滤饼，60℃干燥8小时得DMCTC盐酸盐，总收率60％，纯度为94.2％。对比例7将含去甲基金霉素的发酵液，发酵单位为3230mg/L，体积为1000mL，用硫酸水溶液调节pH值至1.5，搅拌30分钟，经过0.45μm陶瓷膜过滤，收集滤液。加入3.0％PurumCTAC150，然后用NaOH水溶液调节pH值至7.5，板框过滤，收集滤饼。经过水洗涤后，用硫酸水溶液调节pH值到1.5，加入尿素并维持pH值为1.5，过滤，收集滤饼。用NaOH水溶液调pH至2.5，搅拌，过滤，收集滤液。向滤液加入盐酸至pH值为0.5，搅拌，降温至5℃，结晶6小时，过滤，收集滤饼，60℃干燥8小时得DMCTC盐酸盐，总收率52％，纯度为93.7％。对比例8将含去甲基金霉素的发酵液，发酵单位为3230mg/L，体积为1000mL，用硫酸水溶液调节pH值至1.5，搅拌30分钟，经过0.45μm陶瓷膜过滤，收集滤液。加入3.0％PurumCTAC150，然后用NaOH水溶液调节pH值至9.0，板框过滤，收集滤饼。经过水洗涤后，用硫酸水溶液调节pH值到1.5，加入尿素并维持pH值为1.5，过滤，收集滤饼。用NaOH水溶液调pH至2.5，搅拌，过滤，收集滤液。向滤液加入盐酸至pH值为0.5，搅拌，降温至5℃，结晶6小时，过滤，收集滤饼，60℃干燥8小时得DMCTC盐酸盐，总收率59％，纯度为93.5％。项目DMCTC的总收率/％DMCTC的纯度/％实施例95894.2实施例106094.2对比例75293.7对比例85993.5对比例9将含去甲基金霉素的发酵液，发酵单位为3200mg/L，体积为1000mL，用硫酸水溶液调节pH值至1.5，搅拌30分钟，经过0.45μm陶瓷膜过滤，收集滤液。加入4.0％PurumCEP，然后用NaOH水溶液调节pH值至8.5，板框过滤，收集滤饼。经过水洗涤后，用硫酸水溶液调节pH值到1.5，加入尿素并维持pH值为1.5，过滤，收集滤饼。用NaOH水溶液调pH至2.5，搅拌，过滤，收集滤液。向滤液加入盐酸至pH值为0.5，搅拌，降温至5℃。结晶6小时，过滤，收集滤饼，60℃干燥8小时得DMCTC盐酸盐。对比例10将含去甲基金霉素的发酵液，发酵单位为3200mg/L，体积为1000mL，用硫酸水溶液调节pH值至1.5，搅拌30分钟，经过0.45μm陶瓷膜过滤，收集滤液。加入4.0％PurumBC150，然后用NaOH水溶液调节pH值至8.5，板框过滤，收集滤饼。经过水洗涤后，用硫酸水溶液调节pH值到1.5，加入尿素并维持pH值为1.5，过滤，收集滤饼。用NaOH水溶液调pH至2.5，搅拌，过滤，收集滤液。向滤液加入盐酸至pH值为0.5，搅拌，降温至5℃。结晶6小时，过滤，收集滤饼，60℃干燥8小时得DMCTC盐酸盐。对比例11将含去甲基金霉素的发酵液，发酵单位为3200mg/L，体积为1000mL，用硫酸水溶液调节pH值至1.5，搅拌30分钟，经过0.45μm陶瓷膜过滤，收集滤液。加入4.0％PurumBTAC，然后用NaOH水溶液调节pH值至8.5，板框过滤，收集滤饼。经过水洗涤后，用硫酸水溶液调节pH值到1.5，加入尿素并维持pH值为1.5，过滤，收集滤饼。用NaOH水溶液调pH至2.5，搅拌，过滤，收集滤液。向滤液加入盐酸至pH值为0.5，搅拌，降温至5℃。结晶6小时，过滤，收集滤饼，60℃干燥8小时得DMCTC盐酸盐。项目DMCTC的总收率/％DMCTC的纯度/％对比例92090.5对比例103589.8对比例113886.2对比例12根据专利CN201310575459记载的方法，发明人进行了如下实验，并获得纯度数据。将含去甲基金霉素的发酵液，发酵单位3200mg/L，体积为1000ml，用硫酸水溶液调节pH值至1.5，搅拌30分钟，经过0.45μm陶瓷膜过滤，收集滤液。降温至8℃，用NaOH水溶液调节pH值至9.2，析出晶体，板框过滤，收集滤饼。经过水洗涤后，用盐酸调节pH值到2.8，真空干燥，得产品1.7g，总收率53.1％，纯度84.5％。当前第1页1 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