1.一种高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的构建方法,其特征在于:是以右旋糖酐蔗糖酶基因为模板,去除3’端的1584bp碱基、保留上游3000bp碱基dex-YG-bMU01后重组转化到BL21(DE3)大肠杆菌中获得的BL21(DE3)/dex-YG-bMU01基因工程菌。
2.根据权利要求1所述的构建方法,包括引物设计、重组质粒构建和宿主菌转化各单元过程,其特征在于:
所述引物设计是根据右旋糖酐蔗糖酶基因序列和载体pET-28a-(+)的序列,借助Primer Primer 5软件设计引物如下:
上游引物选择BamH I作为酶切位点:
5’-----CGCGGATCCATGCCATTTACAGAAAAAGT-----3’
下游引物选择Hind III作为酶切位点:
5’---CCCAAGCTTTTATTCTGTCGGTGTGCCA---3’;
所述重组质粒构建是以右旋糖酐蔗糖酶基因为模板,利用PCR扩增技术,得到含BamH I和Hind III酶切位点截短后的基因克隆片段dex-YG-bMU01;将上述的基因克隆片段用BamH I和Hind III双酶切,酶切产物连接到载体pET-28a-(+)的双酶切位点上,得到重组表达质粒pET-28a-(+)-dex-YG-bMU01;
所述宿主菌转化是将重组表达质粒pET-28a-(+)-dex-YG-bMU01转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,经过卡那霉素抗性筛选、酶切、菌液PCR和DNA测序验证后,获得右旋糖酐蔗糖酶工程菌株BL21(DE3)/dex-YG-bMU01。
3.一种权利要求1所述的高枝化型右旋糖酐蔗糖酶工程菌的表达应用,其特征在于:
将基因工程菌BL21(DE3)/dex-YG-bMU01按0.5%的接种量接种到含有40~60μg/ml卡那霉素的LB培养基中,转速250r/min,35~40℃培养16~18小时;从上述培养液中吸取2mL加入至200mL的A培养基中,放置于37℃下摇床培养,当富集培养的菌液用蒸馏水稀释10倍后的OD600在0.20~0.24时即可加入500μL IPTG开始诱导产酶,保持25℃诱导发酵4-6小时,将诱导发酵后的菌悬液在0℃下,6000r/min离心12~15min,一支离心管对应一瓶菌悬液,然后加入蒸馏水振荡清洗,再次离心;向每支离心管中加入20mL pH值5.4的醋酸-醋酸钙缓冲液震荡摇匀,外加冰水浴,超声破碎15min,离心分离,上清液即为粗酶液,酶活80-100U/mL。
4.根据权利要求3所述的表达应用,其特征在于:
所述A培养基中各组分及浓度为:甘油5g/L,葡萄糖5g/L,蛋白胨10g/L,硝酸钾10g/L,Na2HPO4 12H2O 17.105g/L,KH2PO4 3g/L,NH4Cl 1g/L,MgSO4 7H2O 0.1mM/L。
5.根据权利要求3所述的表达应用,其特征在于:
摇床培养采用220~240r/min往复式摇床培养或者260~280r/min回转式摇床培养。
6.根据权利要求3所述的表达应用,其特征在于:
诱导发酵采用220~230r/min往复式摇床诱导发酵或者250~260r/min回转式摇床诱导发酵。