鼠李糖脂生产质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌和应用与流程

本发明属于生物技术领域，涉及鼠李糖脂生产质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌和应用。

背景技术：

鼠李糖脂是生物表面活性剂的重要品种，能显著降低表面张力，具有优良的去垢、乳化和絮凝能力，并且具有无毒和生物降解的特性，在化工、医药、农业和环境修复等领域具有广阔的应用前景。

鼠李糖脂最早于1949年由Jarvis和Johnson在铜绿假单胞菌中发现获得。铜绿假单胞菌能合成多种结构的鼠李糖脂，主要有双糖双脂结构、单糖双脂结构、双糖单脂结构和单糖单脂结构四种结构类型。其中脂肪链的长度及饱和程度不同，且各亚种菌株合成不同结构鼠李糖脂的比例不同，造成不同菌株合成的表面活性产物的性能各异。虽然铜绿假单胞菌是合成鼠李糖脂最主要的菌种，但由于其具有条件致病性，它合成鼠李糖脂的行为也与其致病性相关，因此限制了该菌种在鼠李糖脂生产上的应用。

铜绿假单胞菌合成鼠李糖脂的代谢途径受到群体感应系统(QS)的调控，其产物生成与细胞生长状态间存在复杂的耦合关系。如RhlI/R系统直接调控鼠李糖脂合成途径的转录表达，而LasI/R系统通过调控RhlI/R系统的转录来间接控制鼠李糖脂合成；再加上QS信号分子的淬灭系统对两套QS系统的负调控，构成对鼠李糖脂合成途径的转录调控网络。在这些调控元件综合作用下，细胞合成鼠李糖脂的产量和产率受到细胞密度等多种因素的复合控制。此外，假单胞菌合成的表面活物质主要为单鼠李糖脂和双鼠李糖脂，分别由rhlAB和rhlC编码的鼠李糖基转移酶I和II催化合成，而rhlAB与rhlC位于基因组中不同位置，并受不同启动子调控转录。合成鼠李糖脂前体的代谢途径，如鼠李糖合成、脂肪酸合成途径中涉及的rmlBDAC、rhlYZ等基因也受不同QS系统调控转录。因此，不同生长状态下，鼠李糖脂合成的完整途径中，各反应步骤受调控表达的水平不同，造成产物单、双鼠李糖脂及代谢中间产物的比例不同，产物的表面活性、乳化性等亦有区别，影响发酵产品性能的稳定性。在发酵过程方面，铜绿假单胞菌以油脂为原料合成鼠李糖脂，造成鼠李糖脂产物成分复杂，增加了产物分离纯化的成本。

采用大肠杆菌工程菌利用葡萄糖合成单鼠李糖脂，较为安全，遗传背景清晰，产物具有表面活性，产物的生物合成过程不受细胞群体感应的影响，可进行外源诱导物的人工调控合成，增强了生产过程的可控性，具有很好的应用前景。

然而，现阶段所使用的大肠杆菌工程菌都是通过克隆铜绿假单胞菌基因组中rhlAB、rhlC等基因，导入大肠杆菌宿主细胞中。如Wang等构建的E.coli TnERAB，单鼠李糖脂产量为175mg/L(Qinhong Wang,Xiangdong Fang,Baojun Bai,et al.Biotechnology and Bioengineering,2007,98(4):842-853)。Han等人扩增铜绿假单胞中rhlAB和rhlC基因，形成rhlAB-rhlC串联形式置于载体pET-30a(+)的T7启动子下游，鼠李糖脂产物中含有单鼠李糖脂和双鼠李糖脂，产量为120mg/L(L Han,P Liu,Y Peng,et al.Journal of Applied Microbiology,2014,117(1):139-150)。Cabrera-Valladares等将铜绿假单胞菌中rhlAB基因和鼠李糖合成基因簇rmlBDAC同时在大肠杆菌中表达，单鼠李糖脂产量为120mg/L(Natividad Cabrera-Valladares,Anne-Pascale Richardson,Clarita Olvera,et al.Applied Microbiology and Biotechnology,2006,73(1):187-194)。这些工作均未对鼠李糖脂合成基因进行针对大肠杆菌宿主的密码子优化和基因簇结构的优化，鼠李糖脂产量较低。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供鼠李糖脂生产质粒。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述鼠李糖脂生产质粒的构建方法。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供由上述鼠李糖脂生产质粒获得的大肠杆菌工程菌。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述大肠杆菌工程菌的应用。

本发明的技术方案如下：

一种鼠李糖脂生产质粒，质粒DJ202，核苷酸序列为序列表<400>1所示序列。

上述鼠李糖脂生产质粒(质粒DJ202)的构建方法，具体步骤如下：

(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA，其基因序列为序列表<400>3所示序列；将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游，得到质粒DJ201；

(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB，其基因序列为序列表<400>4所示序列；在SyrhlB上游设计大肠杆菌核糖体结合位点RBS，其基因序列为序列表<400>5所示序列，构成片段RBS-SyrhlB，并人工合成；

(3)将片段RBS-SyrhlB通过酶切连接方式插入质粒DJ201中SyrhlA下游，构成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB，获得质粒DJ202。

由上述鼠李糖脂生产质粒获得的大肠杆菌工程菌，是由上述质粒DJ202导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得用于合成鼠李糖脂的大肠杆菌基因工程菌株BL202。

一种鼠李糖脂生产质粒，质粒DJ208，核苷酸序列为序列表<400>2所示序列。

上述鼠李糖脂生产质粒(质粒DJ208)的构建方法，具体步骤如下：

(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA，其基因序列为序列表<400>3所示序列；将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游，得到质粒DJ201；

(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB，其基因序列为序列表<400>4所示序列；在SyrhlB上游设计大肠杆菌核糖体结合位点RBS，其基因序列为序列表<400>5所示序列，构成片段RBS-SyrhlB，并人工合成；

(3)将片段RBS-SyrhlB通过酶切连接方式插入质粒DJ201中SyrhlA下游，构成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB，获得质粒DJ202；

(4)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlC，其基因序列为序列表<400>6所示序列；将SyrhlC通过酶切连接方式插入双启动子质粒pACYCDuet-1第二个T7启动子下游，获得质粒DJ205；

(5)将片段SyrhlA-RBS-SyrhlB通过PCR和酶切连接方式插入质粒DJ205中第一个T7启动子下游，获得质粒DJ208。

由上述鼠李糖脂生产质粒获得的大肠杆菌工程菌，是由上述质粒DJ208导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得用于合成鼠李糖脂的大肠杆菌基因工程菌株BL208。

由上述鼠李糖脂生产质粒获得的大肠杆菌工程菌，BL208/402，是由下述方法构建得到的：

(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA，其基因序列为序列表<400>3所示序列；将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游，得到质粒DJ201；

(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB，其基因序列为序列表<400>4所示序列；在SyrhlB上游设计大肠杆菌核糖体结合位点RBS，其基因序列为序列表<400>5所示序列，构成片段RBS-SyrhlB，并人工合成；

(3)将片段RBS-SyrhlB通过酶切连接方式插入质粒DJ201中SyrhlA下游，构成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB，获得质粒DJ202；

(4)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlC，其基因序列为序列表<400>6所示序列；将SyrhlC通过酶切连接方式插入双启动子质粒pACYCDuet-1第二个T7启动子下游，获得质粒DJ205；

(5)将片段SyrhlA-RBS-SyrhlB通过PCR和酶切连接方式插入质粒DJ205中第一个T7启动子下游，获得质粒DJ208；

(6)通过PCR方式扩增大肠杆菌dTDP-4-脱氢鼠李糖还原酶基因rfbD，通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达载体pRSFDuet-1的T7启动子下游，获得质粒DJ402；

(7)将所述质粒DJ208和DJ402共同导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到合成鼠李糖脂的大肠杆菌基因工程菌株BL208/402。

由上述鼠李糖脂生产质粒获得的大肠杆菌工程菌，BL208/301，是由下述方法构建得到的：

(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA，其基因序列为序列表<400>3所示序列；将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游，得到质粒DJ201；

(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB，其基因序列为序列表<400>4所示序列；在SyrhlB上游设计大肠杆菌核糖体结合位点RBS，其基因序列为序列表<400>5所示序列，构成片段RBS-SyrhlB，并人工合成；

(3)将片段RBS-SyrhlB通过酶切连接方式插入质粒DJ201中SyrhlA下游，构成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB，获得质粒DJ202；

(4)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlC，其基因序列为序列表<400>6所示序列；将SyrhlC通过酶切连接方式插入双启动子质粒pACYCDuet-1第二个T7启动子下游，获得质粒DJ205；

(5)将片段SyrhlA-RBS-SyrhlB通过PCR和酶切连接方式插入质粒DJ205中第一个T7启动子下游，获得质粒DJ208；

(6)通过PCR方式扩增大肠杆菌ACP转酰基酶基因fabD，通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达载体pTrcHisA的trc启动子下游，获得质粒DJ301；

(7)将所述质粒DJ208和DJ301共同导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到合成鼠李糖脂的大肠杆菌基因工程菌株BL208/301。

上述大肠杆菌工程菌在大肠杆菌合成鼠李糖脂中的应用。

优选的，上述大肠杆菌工程菌的应用，具体步骤为：将工程菌株活化后以1-5％的接种量转接到发酵培养基中，30-37℃160-200r/min培养1-3h，添加0.1-1mM IPTG诱导基因表达，添加氨苄青霉素、氯霉素和硫酸卡那霉素/或和氨苄青霉素，30-37℃160-200r/min培养42-48h；其中，发酵培养基(g/L)：葡萄糖3-5，蛋白胨8-12，酵母粉3-6，NaCl 8-12，pH 6.8-7.2。

本发明的有益效果：

本发明对已知的鼠李糖基转移酶基因rhlA、rhlB、rhlC根据大肠杆菌密码子的偏爱性进行优化和人工合成，并合成连接大肠杆菌核糖体结合位点RBS，构建为含基因簇SyrhlA-RBS-SyrhlB形式的质粒DJ202；利用双启动子载体，构建为含T7启动子-SyrhlA-RBS-SyrhlB-T7启动子-SyrhlC形式的质粒DJ208；构建的质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)后，获得了产鼠李糖脂的大肠杆菌工程菌；进一步通过过表达大肠杆菌鼠李糖合成途径或脂肪酸合成途径中的内源基因rfbD或fabD，与质粒DJ208共转化入大肠杆菌BL21(DE3)后，获得含双质粒的大肠杆菌工程菌株，提高了工程菌株鼠李糖脂产量。所述大肠杆菌工程菌株，避免了铜绿假单胞菌的致病性，培养过程更为安全；避免了铜绿假单胞菌中鼠李糖脂合成受细胞群体感应调控的特点，能够通过添加化学诱导物诱导产物生成，便于发酵过程的调控；能够利用葡萄糖为碳源合成鼠李糖脂，避免使用成分复杂的油脂作为碳源，降低了发酵产物提取的难度和成本。

附图说明

图1为大肠杆菌中构建产鼠李糖脂工程菌株代谢相关途径。

图2为本发明构建质粒的遗传图谱。

A：质粒DJ202图谱。

B：质粒DJ208图谱。

C：质粒DJ402图谱。

D：质粒DJ301图谱。

图3为本发明大肠杆菌工程菌株BL202、BL208发酵产物LC-MS分析图谱。

A：工程菌BL202的液相色谱图。

B：工程菌BL208的液相色谱图。

C：发酵产物中单鼠李糖脂Rha-C8-C10的质谱图。

D：发酵产物中单鼠李糖脂Rha-C10-C10的质谱图。

E：发酵产物中双鼠李糖脂Rha-Rha-C8-C10的质谱图。

F：发酵产物中双鼠李糖脂Rha-Rha-C10-C10的质谱图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。

下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1产鼠李糖脂工程菌株的构建

1.鼠李糖脂合成基因载体构建

(1)SyrhlA基因、SyrhlB基因和SyrhlC基因的密码子优化及合成

本实施例中鼠李糖基转移酶基因rhlA、rhlB、rhlC的原始序列均来源于铜绿假单胞(Pseudomonas aeruginosa PAO1)，参照大肠杆菌偏爱性密码子表对rhlA(原始基因序列见GenBank GI:9949623)中的密码子进行优化，并适当规避常用的限制性酶切位点。优化后的基因命名为SyrhlA(序列表<400>3所示序列)，在两端分别添加NdeI和BamHI限制性酶切位点，由苏州金唯智生物科技有限公司合成并连接至pET21-21a(+)载体的NdeI与BamHI位点间，获得质粒DJ201。同样的方法对rhlB(原始序列为GenBank GI:9949622)进行密码子优化，优化后的基因命名为SyrhlB(序列表<400>4所示序列)，在其上游引入大肠杆菌核糖体结合位点RBS(序列表<400>5所示序列)，形成RBS-SyrhlB的结构，在RBS-SyrhlB两端分别添加EcoRI和HindIII限制性酶切位点，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

同样的方法对rhlC(原始序列为GenBank GI:9947050)进行密码子优化，优化后的基因命名为SyrhlC(序列表<400>6所示序列)，在两端分别添加NdeI和KpnI限制性酶切位点，由苏州金唯智生物科技有限公司合成并连接至pACYCDuet-1载体的NdeI与KpnI位点间，获得质粒DJ205。

(2)质粒DJ202的构建

将RBS-SyrhlB片段与质粒DJ201用EcoRI和HindIII内切酶进行酶切、连接，形成T7启动子-SyrhlA-RBS-SyrhlB的形式，得到质粒DJ202，DJ202的质粒图谱为图2-A。

(3)质粒DJ208的构建

以质粒DJ202为扩增模板，以rhlAB-6f(序列表<400>7所示序列)为上引，以rhlAB-6r(序列表<400>8所示序列)为下引，PCR扩增得到SyrhlA-RBS-SyrhlB片段并用试剂盒纯化回收。PCR反应体系为模板1μL，上下引物各0.5μL，Fastpfu酶2.5μL，5×反应缓冲液10μL，dNTP 5μL，超纯水30.5μL。PCR反应程序95℃30s，95℃30s，55℃30s，72℃1min30s，72℃5min，其中第2步到第5步循环30次。用限制性内切酶NcoI和SacI分别对PCR扩增获得的SyrhlA-RBS-SyrhlB片段和质粒DJ205进行双酶切，纯化后用T4 DNA连接酶连接，并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞。Fastpfu酶购自北京全式金公司，dNTP、限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自TAKARA公司，感受态细胞购自北京博迈德生物技术有限公司。菌落PCR筛选阳性克隆提质粒送至北京金唯智生物科技有限公司测序，测序正确后命名该质粒为DJ208，DJ208的质粒图谱为图2-B。

2.鼠李糖合成途径中rfbD基因过表达载体的构建

根据大肠杆菌BL21(DE3)基因组GenBank GI:313848522中的dTDP-4-脱氢鼠李糖还原酶基因rfbD序列(GenBank GI:242377692)设计引物：上引rfbD-1f(序列表<400>9所示序列)，下引rfbD-1r(序列表<400>10所示序列)，引物两端添加了NdeI和KpnI酶切位点序列。该基因是大肠杆菌内源途径中鼠李糖前体合成的关键基因，如图1所示。用试剂盒提取大肠杆菌BL21(DE3)菌株的基因组作为PCR扩增模板，以rfbD-1f/rfbD-1r为引物PCR扩增rfbD基因。PCR反应体系为模板1μL，上下引物各0.5μL，Fastpfu酶2.5μL，5×反应缓冲液10μL，dNTP 5μL，超纯水30.5μL。PCR反应程序95℃ 30s，95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，72℃ 5min，其中第2步到第5步循环30次。用限制性内切酶NdeI和KpnI分别对PCR扩增获得的片段和质粒pRSFDuet-1进行双酶切，纯化后用T4DNA连接酶连接，并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞。Fastpfu酶购自北京全式金公司，dNTP、限制性内切酶和T4DNA连接酶购自TAKARA公司，感受态细胞购自北京博迈德生物技术有限公司。菌落PCR筛选阳性克隆提质粒送至北京金唯智生物科技有限公司测序，测序正确后命名该质粒为DJ402，DJ402的质粒图谱为图2-C。

3.脂肪酸合成途径中fabD基因过表达载体的构建

根据大肠杆菌BL21(DE3)基因组GenBank GI:313848522中的ACP转酰基酶基因fabD序列(GenBank GI:242376895)设计引物：上引fabD-1f(序列表<400>11所示序列)，下引fabD-1r(序列表<400>12所示序列)，引物两端添加了NcoI和BamHI酶切位点序列。该基因是大肠杆菌内源途径中脂肪酸前体合成的关键基因，如图1所示。以fabD-1f/fabD-1r为引物，用与rfbD基因扩增相同的PCR体系和反应程序进行PCR扩增。用限制性内切酶NcoI和BamHI分别对PCR扩增获得的片段和质粒pTrcHisA进行双酶切，纯化后用T4DNA连接酶连接，并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞。菌落PCR筛选阳性克隆测序正确后命名该质粒为DJ301，DJ301的质粒图谱为图2-D。试剂和方法与构建质粒DJ402相同。

4.产鼠李糖脂大肠杆菌工程菌株的构建

将质粒DJ202转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到产鼠李糖脂大肠杆菌工程菌株，命名为菌株BL202。将质粒DJ208转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到产鼠李糖脂大肠杆菌工程菌株，命名为菌株BL208。将质粒DJ208和质粒DJ402转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到产鼠李糖脂大肠杆菌工程菌株，命名为菌株BL208/402。将质粒DJ208和质粒DJ301转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到产鼠李糖脂大肠杆菌工程菌株，命名为菌株BL208/301。大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购自北京博迈德生物技术有限公司。

实施例2产鼠李糖脂大肠杆菌工程菌摇瓶发酵验证

1.发酵过程

挑取大肠杆菌工程菌BL202单菌落于5mL含100μg/mL氨苄青霉素的液体LB试管中，37℃，180r/min振荡培养过夜后，按1％的接种量接种于50mL含100μg/mL氨苄青霉素的发酵培养基中，37℃，180r/min振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入1mM的IPTG诱导基因的表达，培养46h，得到发酵液。

用相同的培养方法对工程菌BL208，BL208/402，BL208/301进行发酵，其中BL208的培养基中添加50μg/mL氯霉素，BL208/402的培养基中添加50μg/mL氯霉素和50μg/mL硫酸卡那霉素，BL208/301的培养基中添加50μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄青霉素。

2.发酵液中鼠李糖脂的提取

将上述步骤中收集的发酵液于4℃、8000r/min离心15min，取上清液，用6mol/L的HCl溶液调节上清液pH至2.0，静置于4℃过夜；4℃、10000r/min离心20min，取沉淀，并用pH 2.0的HCl溶液洗涤沉淀3次，用3mL氯仿：乙醇(2:1，v/v)萃取3次，合并收集有机相，干燥后得到粉末为发酵产物的粗提物，用于液质联用(LC-MS)测定。

取吸取1mL发酵液离心后的上清液用3mL氯仿：乙醇(2:1，v/v)萃取3次，合并收集有机相，蒸干后加水复溶得到样品，用于鼠李糖脂浓度测定。

3.发酵产物的液质联用(LC-MS)测定

色谱柱为Angilent SB-CB(2.1mm×100mm,1.8μm)；流动相由A相(甲酸：水＝0.1:100)和B相(甲酸：乙腈＝0.1:100)组成，流速：0.2mL/min；柱温：30℃；进样量：5μL。梯度洗脱程序：0min，10％B；3min，10％B；33min，90％B；65min，90％B。HPLC/Q-TOF-MS系统使用ESI离子源，在负离子模式下采集数据。离子采集范围：200-1000m/z。产鼠李糖脂大肠杆菌工程菌株BL202中测到了单鼠李糖脂(液相色谱图为图3-A)，菌株BL208中测到了单鼠李糖脂和双鼠李糖脂(液相色谱图为图3-B)，其中单鼠李糖脂质谱图为图3-C、图3-D，双鼠李糖脂质谱图为图3-E、图3-F。结果表明，本发明中含优化合成基因SyrhlA、SyrhlB、SyrhlC的重组质粒DJ202和DJ208能够实现大肠杆菌产鼠李糖脂。

4.鼠李糖脂浓度测定

采用硫酸-蒽酮法测定鼠李糖脂的含量：取1mL适当稀释后的样品，加5mL蒽酮-硫酸试剂(蒽酮-硫酸试剂：取0.2g蒽酮溶于100mL体积分数75％H₂SO₄溶液，现配现用)，沸水浴10min，冷却至室温后测定OD₆₂₀，根据已测得的鼠李糖标准曲线计算得到样品中鼠李糖含量，乘以系数3和稀释倍数得到发酵液中鼠李糖脂含量。产鼠李糖脂大肠杆菌工程菌BL202、BL208、BL208/402和BL208/301发酵液中鼠李糖脂含量分别为：707mg/L、575mg/L、672mg/L和617mg/L。

之前有关产鼠李糖脂大肠杆菌工程菌的报道均是通过扩增铜绿假单胞中rhlAB基因簇并构建重组质粒在大肠杆菌中表达并合成单鼠李糖脂，未进行密码子优化和基因簇结构的优化，鼠李糖脂产量较低。如Wang等构建的E.coli TnERAB，单鼠李糖脂产量为175mg/L(Qinhong Wang,Xiangdong Fang,Baojun Bai,et al.Biotechnology and Bioengineering,2007,98(4):842-853)。本发明中优化设计并人工合成的SyrhlA-RBS-SyrhlB基因簇，利用载体pET-21a(+)中的T7启动子构建为质粒DJ202，使大肠杆菌合成单鼠李糖脂，产量提高至707mg/L。Han等人扩增铜绿假单胞中rhlAB和rhlC基因，形成rhlAB-rhlC串联形式置于载体pET-30a(+)的T7启动子下游，鼠李糖脂产物中含有单鼠李糖脂和双鼠李糖脂，产量为(120mg/L)(L Han,P Liu,Y Peng,et al.Journal of Applied Microbiology,2014,117(1):139-150)。本发明中优化合成的SyrhlA-RBS-SyrhlB和SyrhlC分别置于载体pACYCDuet-1两个T7启动子下游，使大肠杆菌合成单鼠李糖脂和双鼠李糖脂，产量提高至575mg/L。Cabrera-Valladares等将铜绿假单胞菌中rhlAB基因和鼠李糖合成基因簇rmlBDAC同时在大肠杆菌中表达，单鼠李糖脂产量为120mg/L(Natividad Cabrera-Valladares,Anne-Pascale Richardson,Clarita Olvera,et al.Applied Microbiology and Biotechnology,2006,73(1):187-194)。本发明还通过构建强化表达大肠杆菌内源的dTDP-4-脱氢鼠李糖还原酶基因rfbD或ACP转酰基酶基因fabD的质粒，并与质粒DJ208共转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，进一步将含双鼠李糖脂产物的产量提高至672mg/L和617mg/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

<110> 国家海洋局天津海水淡化与综合利用研究所

<120> 鼠李糖脂生产质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌和应用

<130> 2016

<141> 2016-11-02

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 7578

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> 质粒DJ202

<222> (1)..(7578)

<400> 1

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600

gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660

ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720

agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780

agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840

tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900

tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960

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aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080

tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140

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caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620

aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680

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accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980

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tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100

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gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640

gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 2700

catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760

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tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940

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atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg 4020

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cgcagacgcg ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc 4200

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gacaccacca cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc 4500

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ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc 5160

cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acatatgcgc cgcgaaagcc 5220

tgctggtgag cgtgtgcaag ggcctgcgtg tgcatgttga acgcgttggt caagatcctg 5280

gtcgtagtac cgtgatgctg gtgaatggtg ctatggctac aaccgccagc tttgcccgta 5340

cctgcaaatg cctggccgaa cacttcaacg tggtgctgtt tgatctgccg tttgccggtc 5400

agagccgtca gcacaatccg cagcgcggcc tgatcaccaa ggacgacgag gttgaaatcc 5460

tgctggcact gatcgaacgc ttcgaagtga atcacctggt tagcgcaagc tggggtggta 5520

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tgccgcagcg tctgaaggca agcaaccatc agcacatggc cagcctggca accggcgaat 5760

atgagcaggc acgctttcac attgatcagg tgctggcact gaatgatcgc ggctatctgg 5820

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ccaccgcaga agacgcccgc cagtttcgcg actatctgcc gcactgtagc tttagccgtg 5940

ttgaaggcac cggccacttt ctggacctgg aaagtaaact ggcagccgtt cgtgtgcacc 6000

gcgccttact ggaacacctg ctgaaacaac cggaaccgca gcgtgcagaa cgtgcagccg 6060

gctttcatga gatggccatc ggttatgcat aaggatccga attcaaagga ggccatccta 6120

tgcatgcaat cctgattgcc attggtagtg ccggtgacgt gtttccgttt atcggcctgg 6180

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acgccgtgga acaacatggt attgcctttg tgccgctgag cgacgaactg acatatcgtc 6300

gtactatggg tgatccgcgc ctgtgggacc ctaaaaccag ctttggcgtg ctgtggcagg 6360

caatcgccgg catgatcgag ccggtgtacg aatatgtgag tgcccagcgt catgacgata 6420

tcgtggttgt gggcagcctg tgggccttag gcgcacgtat tgcccacgaa aagtacggca 6480

tcccgtatct gagcgcccag gttagtccga gcaccctgct gagcgcacat ctgccgccgg 6540

tgcatccgaa gttcaacgtg ccggaacaga tgccgctggc catgcgcaaa ctgctgtggc 6600

gctgcattga acgtttcaag ctggaccgca catgcgcccc ggagatcaac gcagtgcgcc 6660

gtaaagtggg cctggaaacc ccggtgaaac gtatctttac ccagtggatg cacagcccgc 6720

agggcgttgt gtgtctgttt ccggcatggt ttgccccgcc gcagcaggat tggccgcagc 6780

cgctgcacat gaccggcttt ccgctgttcg atggtagcat tcctggcacc ccgttagacg 6840

atgaactgca gcgcttcctg gaccagggta gccgtccgct ggtgtttaca cagggcagca 6900

ccgagcatct gcagggcgat ttttacgcta tggctctgcg cgccctggaa cgtttaggtg 6960

cacgtggcat cttcctgacc ggtgccggtc aggaacctct gcgtggcctg cctaaccatg 7020

tgctgcagcg cgcttatgct ccgttaggtg ccctgctgcc gagctgtgcc ggtctggttc 7080

atccgggtgg cattggtgca atgagtctgg ccctggcagc aggtgttccg caggtgctgc 7140

tgccgtgcgc ccacgatcag tttgataatg ccgaacgcct ggtgcgtctg ggttgcggta 7200

tgcgcttagg tgtgcctctg cgcgagcagg agttacgcgg tgcactgtgg cgtctgctgg 7260

aagatccggc aatggccgca gcctgtcgtc gctttatgga gctgagccag ccgcatagca 7320

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ggctgaaagc cgccagttaa aagcttgcgg ccgcactcga gcaccaccac caccaccact 7440

gagatccggc tgctaacaaa gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc 7500

aataactagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaag 7560

gaggaactat atccggat 7578

<210> 2

<211> 7090

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> 质粒DJ208

<222> (1)..(7090)

<400> 2

ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60

gagatatacc atggcgcgcc gcgaaagcct gctggtgagc gtgtgcaagg gcctgcgtgt 120

gcatgttgaa cgcgttggtc aagatcctgg tcgtagtacc gtgatgctgg tgaatggtgc 180

tatggctaca accgccagct ttgcccgtac ctgcaaatgc ctggccgaac acttcaacgt 240

ggtgctgttt gatctgccgt ttgccggtca gagccgtcag cacaatccgc agcgcggcct 300

gatcaccaag gacgacgagg ttgaaatcct gctggcactg atcgaacgct tcgaagtgaa 360

tcacctggtt agcgcaagct ggggtggtat cagcaccctg ctggcactga gccgtaatcc 420

gcgcggtatt cgcagtagcg tggtgatggc ctttgccccg ggcctgaacc aggccatgct 480

ggattatgtt ggccgcgcac aagccctgat cgagctggat gacaaaagcg ccattggcca 540

tctgctgaat gagaccgtgg gcaaatacct gccgcagcgt ctgaaggcaa gcaaccatca 600

gcacatggcc agcctggcaa ccggcgaata tgagcaggca cgctttcaca ttgatcaggt 660

gctggcactg aatgatcgcg gctatctggc ctgcctggag cgcatccaga gccacgtgca 720

cttcatcaat ggcagctggg acgaatacac caccgcagaa gacgcccgcc agtttcgcga 780

ctatctgccg cactgtagct ttagccgtgt tgaaggcacc ggccactttc tggacctgga 840

aagtaaactg gcagccgttc gtgtgcaccg cgccttactg gaacacctgc tgaaacaacc 900

ggaaccgcag cgtgcagaac gtgcagccgg ctttcatgag atggccatcg gttatgcata 960

aggatccgaa ttcaaaggag gccatcctat gcatgcaatc ctgattgcca ttggtagtgc 1020

cggtgacgtg tttccgttta tcggcctggc ccgtaccctg aaactgcgtg gccaccgtgt 1080

gagcctgtgt accattccgg tgtttcgcga cgccgtggaa caacatggta ttgcctttgt 1140

gccgctgagc gacgaactga catatcgtcg tactatgggt gatccgcgcc tgtgggaccc 1200

taaaaccagc tttggcgtgc tgtggcaggc aatcgccggc atgatcgagc cggtgtacga 1260

atatgtgagt gcccagcgtc atgacgatat cgtggttgtg ggcagcctgt gggccttagg 1320

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caccctgctg agcgcacatc tgccgccggt gcatccgaag ttcaacgtgc cggaacagat 1440

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tgccccgccg cagcaggatt ggccgcagcc gctgcacatg accggctttc cgctgttcga 1680

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ccgtccgctg gtgtttacac agggcagcac cgagcatctg cagggcgatt tttacgctat 1800

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catgtggata ccgagtatag cctgcgtgcc caggcactgg acgttccgct gtatgttgat 3060

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ctgacacagg gtctggccgt gctgctgctg gaacgcgata aactgctgaa gctgcgttgt 3300

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cctcgcttac tgaaacgcct ggcaggcccg gcagttgcaa gcgttgccag cggtaaagca 3420

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cacatggact cgtctactag cgcagcttaa ttaacctagg ctgctgccac cgctgagcaa 3540

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gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt ttcagtttgc tcatggaaaa cggtgtaaca 4200

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tttctttacg gtctttaaaa aggccgtaat atccagctga acggtctggt tataggtaca 4380

ttgagcaact gactgaaatg cctcaaaatg ttctttacga tgccattggg atatatcaac 4440

ggtggtatat ccagtgattt ttttctccat tttagcttcc ttagctcctg aaaatctcga 4500

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tacgtgccga tcaacgtctc attttcgcca aaagttggcc cagggcttcc cggtatcaac 4620

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ttccacgcct gacactcagt tccgggtagg cagttcgctc caagctggac tgtatgcacg 5340

aaccccccgt tcagtccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 5400

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cctccaagcc agttacctcg gttcaaagag ttggtagctc agagaacctt cgaaaaaccg 5580

ccctgcaagg cggttttttc gttttcagag caagagatta cgcgcagacc aaaacgatct 5640

caagaagatc atcttattaa tcagataaaa tatttctaga tttcagtgca atttatctct 5700

tcaaatgtag cacctgaagt cagccccata cgatataagt tgtaattctc atgttagtca 5760

tgccccgcgc ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag 5820

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gcggtttgcg tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc 6000

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cccagcaggc gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct 6120

tcggtatcgt cgtatcccac taccgagatg tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta 6180

atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg 6240

atgccctcat tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct 6300

tcccgttccg ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga 6360

cgcagacgcg ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc 6420

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ttgatgggtg tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct 6540

tccacagcaa tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt 6600

tgcgcgagaa gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc 6660

gacaccacca cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc 6720

gacggcgcgt gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc 6780

gccagttgtt gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact 6840

ttttcccgcg ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga 6900

taagagacac cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc 6960

ctgaattgac tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg 7020

atggtgtccg ggatctcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga aattaatacg 7080

actcactata 7090

<210> 3

<211> 888

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> 鼠李糖基转移酶基因SyrhlA

<222> (1)..(888)

<400> 3

atgcgccgcg aaagcctgct ggtgagcgtg tgcaagggcc tgcgtgtgca tgttgaacgc 60

gttggtcaag atcctggtcg tagtaccgtg atgctggtga atggtgctat ggctacaacc 120

gccagctttg cccgtacctg caaatgcctg gccgaacact tcaacgtggt gctgtttgat 180

ctgccgtttg ccggtcagag ccgtcagcac aatccgcagc gcggcctgat caccaaggac 240

gacgaggttg aaatcctgct ggcactgatc gaacgcttcg aagtgaatca cctggttagc 300

gcaagctggg gtggtatcag caccctgctg gcactgagcc gtaatccgcg cggtattcgc 360

agtagcgtgg tgatggcctt tgccccgggc ctgaaccagg ccatgctgga ttatgttggc 420

cgcgcacaag ccctgatcga gctggatgac aaaagcgcca ttggccatct gctgaatgag 480

accgtgggca aatacctgcc gcagcgtctg aaggcaagca accatcagca catggccagc 540

ctggcaaccg gcgaatatga gcaggcacgc tttcacattg atcaggtgct ggcactgaat 600

gatcgcggct atctggcctg cctggagcgc atccagagcc acgtgcactt catcaatggc 660

agctgggacg aatacaccac cgcagaagac gcccgccagt ttcgcgacta tctgccgcac 720

tgtagcttta gccgtgttga aggcaccggc cactttctgg acctggaaag taaactggca 780

gccgttcgtg tgcaccgcgc cttactggaa cacctgctga aacaaccgga accgcagcgt 840

gcagaacgtg cagccggctt tcatgagatg gccatcggtt atgcataa 888

<210> 4

<211> 1281

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> 鼠李糖基转移酶基因SyrhlB

<222> (1)..(1281)

<400> 4

atgcatgcaa tcctgattgc cattggtagt gccggtgacg tgtttccgtt tatcggcctg 60

gcccgtaccc tgaaactgcg tggccaccgt gtgagcctgt gtaccattcc ggtgtttcgc 120

gacgccgtgg aacaacatgg tattgccttt gtgccgctga gcgacgaact gacatatcgt 180

cgtactatgg gtgatccgcg cctgtgggac cctaaaacca gctttggcgt gctgtggcag 240

gcaatcgccg gcatgatcga gccggtgtac gaatatgtga gtgcccagcg tcatgacgat 300

atcgtggttg tgggcagcct gtgggcctta ggcgcacgta ttgcccacga aaagtacggc 360

atcccgtatc tgagcgccca ggttagtccg agcaccctgc tgagcgcaca tctgccgccg 420

gtgcatccga agttcaacgt gccggaacag atgccgctgg ccatgcgcaa actgctgtgg 480

cgctgcattg aacgtttcaa gctggaccgc acatgcgccc cggagatcaa cgcagtgcgc 540

cgtaaagtgg gcctggaaac cccggtgaaa cgtatcttta cccagtggat gcacagcccg 600

cagggcgttg tgtgtctgtt tccggcatgg tttgccccgc cgcagcagga ttggccgcag 660

ccgctgcaca tgaccggctt tccgctgttc gatggtagca ttcctggcac cccgttagac 720

gatgaactgc agcgcttcct ggaccagggt agccgtccgc tggtgtttac acagggcagc 780

accgagcatc tgcagggcga tttttacgct atggctctgc gcgccctgga acgtttaggt 840

gcacgtggca tcttcctgac cggtgccggt caggaacctc tgcgtggcct gcctaaccat 900

gtgctgcagc gcgcttatgc tccgttaggt gccctgctgc cgagctgtgc cggtctggtt 960

catccgggtg gcattggtgc aatgagtctg gccctggcag caggtgttcc gcaggtgctg 1020

ctgccgtgcg cccacgatca gtttgataat gccgaacgcc tggtgcgtct gggttgcggt 1080

atgcgcttag gtgtgcctct gcgcgagcag gagttacgcg gtgcactgtg gcgtctgctg 1140

gaagatccgg caatggccgc agcctgtcgt cgctttatgg agctgagcca gccgcatagc 1200

attgcctgcg gtaaagcagc ccaggtggtg gaacgctgtc accgcgaagg tgatgcccgc 1260

tggctgaaag ccgccagtta a 1281

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> 大肠杆菌核糖体结合位点RBS

<222> (1)..(15)

<400> 5

aaaggaggcc atcct 15

<210> 6

<211> 978

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> 鼠李糖基转移酶基因SyrhlC

<222> (1)..(978)

<400> 6

atggatcgca ttgatatggg cgtgctggtg gttctgttca atccgggcga cgatgatctg 60

gaacacctgg gtgagctggc agccgccttt ccgcagctgc gttttctggc cgttgacaat 120

agcccgcata gcgatccgca gcgtaatgcc cgtctgcgtg gccaaggtat tgccgtttta 180

caccacggca accgccaggg tattgccggt gcctttaatc agggcctgga tgcactgttc 240

cgccgtggtg ttcagggcgt tctgctgctg gaccaggata gccgtccggg tggtgccttt 300

ctggcagccc agtggcgcaa tctgcaggcc cgtaatggcc aggcatgtct gctgggtccg 360

cgtatctttg atcgcggcga tcgccgcttt ctgccggcca ttcatttaga tggtctgacc 420

ctgcgccagc tgagtctgga tggcttaacc accccgcagc gtaccagctt tctgattagc 480

agtggctgcc tgctgacccg tgaagcatat cagcgcctgg gccattttga cgaagagctg 540

tttattgatc atgtggatac cgagtatagc ctgcgtgccc aggcactgga cgttccgctg 600

tatgttgatc cgcgcctggt gctggaacat cgcattggca ctcgcaaaac ccgtcgtctg 660

ggcggtctga gtctgagcgc catgaatcat gccccgctgc gccgttatta tctggcacgc 720

aacggtctgc tggttctgcg ccgttacgcc cgtagcagtc cgctggccct gttagccaat 780

ctgccgaccc tgacacaggg tctggccgtg ctgctgctgg aacgcgataa actgctgaag 840

ctgcgttgtc tgggctgggg cttatgggat ggtctgcgtg gtcgtggtgg cgccctggaa 900

acaaatcgcc ctcgcttact gaaacgcctg gcaggcccgg cagttgcaag cgttgccagc 960

ggtaaagcaa aagcataa 978

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> rhlAB-6f

<222> (1)..(32)

<400> 7

gggtccatgg cgcgccgcga aagcctgctg gt 32

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> rhlAB-6r

<222> (1)..(29)

<400> 8

cccgagctct taactggcgg ctttcagcc 29

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> rfbD-1f

<222> (1)..(28)

<400> 9

cggatcatat gaatatcctc ctattcgg 28

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> rfbD-1r

<222> (1)..(29)

<400> 10

cgcggtacct taaattgccg tagtcgtaa 29

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> fabD-1f

<222> (1)..(32)

<400> 11

cgttccatgg cgacgcaatt tgcatttgtg tt 32

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> fabD-1r

<222> (1)..(34)

<400> 12

aaggatcctt aaagctcgag cgccgctgcc atcg 34