鼠李糖脂生产质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌和应用与流程

文档序号:12412090阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种鼠李糖脂生产质粒,其特征在于:为质粒DJ202,核苷酸序列为序列表<400>1所示序列。

2.权利要求1所述鼠李糖脂生产质粒DJ202的构建方法,其特征在于:具体步骤如下:

(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA,其基因序列为序列表<400>3所示序列;将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游,得到质粒DJ201;

(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB,其基因序列为序列表<400>4所示序列;在SyrhlB上游设计大肠杆菌核糖体结合位点RBS,其基因序列为序列表<400>5所示序列,构成片段RBS-SyrhlB,并人工合成;

(3)将片段RBS-SyrhlB通过酶切连接方式插入质粒DJ201中SyrhlA下游,构成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB,获得质粒DJ202。

3.由权利要求1所述鼠李糖脂生产质粒DJ202获得的大肠杆菌工程菌,其特征在于:是由上述质粒DJ202导入到大肠杆菌BL21(DE3)中,获得用于合成鼠李糖脂的大肠杆菌基因工程菌株BL202。

4.一种鼠李糖脂生产质粒,其特征在于:为质粒DJ208,核苷酸序列为序列表<400>2所示序列。

5.权利要求4所述鼠李糖脂生产质粒DJ208的构建方法,其特征在于:具体步骤如下:

(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA,其基因序列为序列表<400>3所示序列;将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游,得到质粒DJ201;

(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB,其基因序列为序列表<400>4所示序列;在SyrhlB上游设计大肠杆菌核糖体结合位点RBS,其基因序列为序列表<400>5所示序列,构成片段RBS-SyrhlB,并人工合成;

(3)将片段RBS-SyrhlB通过酶切连接方式插入质粒DJ201中SyrhlA下游,构成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB,获得质粒DJ202;

(4)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlC,其基因序列为序列表<400>6所示序列;将SyrhlC通过酶切连接方式插入双启动子质粒pACYCDuet-1第二个T7启动子下游,获得质粒DJ205;

(5)将片段SyrhlA-RBS-SyrhlB通过PCR和酶切连接方式插入质粒DJ205中第一个T7启动子下游,获得质粒DJ208。

6.由权利要求4所述鼠李糖脂生产质粒DJ208获得的大肠杆菌工程菌,其特征在于:是由上述质粒DJ208导入到大肠杆菌BL21(DE3)中,获得用于合成鼠李糖脂的大肠杆菌基因工程菌株BL208。

7.一种大肠杆菌工程菌,其特征在于:为BL208/402,是由下述方法构建得到的:

(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA,其基因序列为序列表<400>3所示序列;将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游,得到质粒DJ201;

(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB,其基因序列为序列表<400>4所示序列;在SyrhlB上游设计大肠杆菌核糖体结合位点RBS,其基因序列为序列表<400>5所示序列,构成片段RBS-SyrhlB,并人工合成;

(3)将片段RBS-SyrhlB通过酶切连接方式插入质粒DJ201中SyrhlA下游,构成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB,获得质粒DJ202;

(4)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlC,其基因序列为序列表<400>6所示序列;将SyrhlC通过酶切连接方式插入双启动子质粒pACYCDuet-1第二个T7启动子下游,获得质粒DJ205;

(5)将片段SyrhlA-RBS-SyrhlB通过PCR和酶切连接方式插入质粒DJ205中第一个T7启动子下游,获得质粒DJ208;

(6)通过PCR方式扩增大肠杆菌dTDP-4-脱氢鼠李糖还原酶基因rfbD,通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达载体pRSFDuet-1的T7启动子下游,获得质粒DJ402;

(7)将所述质粒DJ208和DJ402共同导入到大肠杆菌BL21(DE3)中,得到合成鼠李糖脂的大肠杆菌基因工程菌株BL208/402。

8.一种大肠杆菌工程菌,其特征在于:为BL208/301,是由下述方法构建得到的:

(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA,其基因序列为序列表<400>3所示序列;将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游,得到质粒DJ201;

(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB,其基因序列为序列表<400>4所示序列;在SyrhlB上游设计大肠杆菌核糖体结合位点RBS,其基因序列为序列表<400>5所示序列,构成片段RBS-SyrhlB,并人工合成;

(3)将片段RBS-SyrhlB通过酶切连接方式插入质粒DJ201中SyrhlA下游,构成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB,获得质粒DJ202;

(4)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlC,其基因序列为序列表<400>6所示序列;将SyrhlC通过酶切连接方式插入双启动子质粒pACYCDuet-1第二个T7启动子下游,获得质粒DJ205;

(5)将片段SyrhlA-RBS-SyrhlB通过PCR和酶切连接方式插入质粒DJ205中第一个T7启动子下游,获得质粒DJ208;

(6)通过PCR方式扩增大肠杆菌ACP转酰基酶基因fabD,通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达载体pTrcHisA的trc启动子下游,获得质粒DJ301;

(7)将所述质粒DJ208和DJ301共同导入到大肠杆菌BL21(DE3)中,得到合成鼠李糖脂的大肠杆菌基因工程菌株BL208/301。

9.权利要求7或8所述大肠杆菌工程菌在大肠杆菌合成鼠李糖脂中的应用。

10.根据权利要求9所述的大肠杆菌工程菌的应用,其特征在于:具体步骤为:将工程菌株活化后以1-5%的接种量转接到发酵培养基中,30-37℃160-200r/min培养1-3h,添加0.1-1mM IPTG诱导基因表达,添加氨苄青霉素、氯霉素和硫酸卡那霉素/或和氨苄青霉素,30-37℃160-200r/min培养42-48h;其中,发酵培养基(g/L):葡萄糖3-5,蛋白胨8-12,酵母粉3-6,NaCl 8-12,pH 6.8-7.2。

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