文蛤多巴脱羧酶基因及其编码蛋白和应用的制作方法

本发明涉及分子生物学和生物工程技术领域，具体的说是一种文蛤多巴脱羧酶基因及其编码蛋白和应用。

背景技术：

多巴脱羧酶是氨基酸脱羧酶的一种，又称色氨酸脱羧酶，可通过催化L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)和L-5-羟色氨酸脱羧合成具有重要生理活性的神经递质多巴胺和5-羟色胺，同时还可催化部分芳香氨基酸脱羧生成对应的生物胺。脑内5-羟色胺含量降低将导致抑郁等常见心境障碍；黑质和纹状体病变致使多巴胺合成减少还可导致帕金森症发生。除了抑郁和帕金森症，多巴脱羧酶还和高血压、失眠、厌食等疾病相关。同时，多巴脱羧酶通过参与儿茶酚胺能神经内分泌免疫调节系统及黑化作用，影响机体的免疫应答，已有报道指出其参与脊椎动物、无脊椎动物、植物的免疫应答，增强机体针对病原的抗性。另外，多巴脱羧酶在植物生长素合成和器官发育过程中发挥重要作用。

多巴脱羧酶的重要作用使其具有广泛的应用价值。重组多巴脱羧酶已作为大批量筛选其抑制剂的靶标，从而应用于临床治疗。文蛤是一种在沿海和滩涂地区广泛分布的双壳贝类，在我国沿海，文蛤作为一种重要的经济贝类而被广泛养殖。目前，还没有从文蛤中获得多巴脱羧酶基因的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是一种文蛤多巴脱羧酶基因及其编码蛋白和应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种文蛤多巴脱羧酶基因，其是通过cDNA文库结合RACE技术从文蛤中克隆得到的多巴脱羧酶的cDNA序列，该序列全长1930bp，其中编码框1599bp，具体为SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列。

所述文蛤多巴脱羧酶基因所编码的蛋白共包含533个氨基酸，具体为SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列。

一种文蛤多巴脱羧酶体外重组表达方法，具体步骤为：通过PCR技术，扩增编码文蛤多巴脱羧酶的基因片段并将其克隆到pGEX-4T-1表达载体中，在IPTG诱导条件下，在大肠杆菌中重组表达该蛋白，重组产物经过GSTrap FF亲和柱纯化，获得含SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列生物多巴脱羧酶重组蛋白。

一种文蛤多巴脱羧酶基因的应用，经检测所重组的蛋白具有多巴脱羧酶活性，同时重组蛋白能够降低弧菌感染文蛤中弧菌菌落数，可以作为备选的贝类免疫增强剂。

本发明所具有的优点：

本发明从文蛤中克隆了多巴脱羧酶cDNA全长序列并原核重组表达了该蛋白，重组蛋白具有多巴脱羧酶活性，能够降低弧菌感染文蛤中弧菌菌落数，可以作为备选的贝类免疫增强剂，同时也具有在医药等其他相关领域的应用前景。本发明重组蛋白具有大规模生产的可能，可以弥补天然蛋白量低以致难以满足需要的局限。

附图说明

图1为本发明实施例提供的纯化的文蛤多巴脱羧酶重组蛋白；其中，M：蛋白marker；1：IPTG诱导前总蛋白；2：IPTG诱导后总蛋白；3：亲和柱纯化后的文蛤多巴脱羧酶-GST重组融合蛋白。

图2为本发明实施例提供的弧菌感染文蛤血淋巴中的弧菌菌落数；其中，1：注射重组多巴脱羧酶的文蛤血淋巴涂板；2：注射PBS的文蛤血淋巴涂板。

具体实施方式

下面的实施例中将本发明作进一步阐述，但本发明不限于此。

本发明利用cDNA文库和RACE技术从文蛤中扩增到文蛤多巴脱羧酶的cDNA全长序列1930bp，其中编码框1599bp，编码蛋白含有533个氨基酸。根据所得序列设计表达引物，扩增全长后经酶切连接到表达载体pGEX-4T-1中，之后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，经过IPTG诱导，然后经过GSTrap FF亲和柱纯化后得到重组多巴脱羧酶。

实施例1.

文蛤多巴脱羧酶基因，具有序列表SEQ ID NO.1所示的序列。

SEQ ID NO.1(加粗斜体部分为编码框序列，能够编码蛋白)

本发明中的文蛤多巴脱羧酶的cDNA序列克隆包括下列步骤：

1)文蛤总RNA的提取及mRNA的纯化；

2)文蛤cDNA文库构建；

3)文蛤cDNA文库EST序列的大规模测定；

4)文蛤EST序列的同源性分析及多巴脱羧酶基因片段的筛选；

5)RACE扩增获得文蛤多巴脱羧酶的全序列以及全序列的验证。

具体操作如下：

1.文蛤总RNA的提取及mRNA的纯化：利用Invitrogen公司的Trizol试剂从文蛤幼虫中提取总RNA，利用QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒纯化mRNA。

2.文蛤cDNA文库构建：利用Stratagene公司cDNA Synthesis Kit和Synthesis Kit(Stratagene)进行cDNA的合成，双链cDNA经末端补平、EcoR I接头连接、EcoR I末端磷酸化、Xho I内切酶酶切后利用QIAGEN公司QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit对大于100bp的酶切片段进行回收，与Invitrogen公司Uni-ZAP XR vector载体连接，利用Stratagene公司的III Gold Cloning Kit试剂盒进行文库包装，利用Exassist Helper Phage和SOLR菌株从XR Vector上体外切割pBluescript成为质粒文库。

3.文蛤cDNA文库EST序列的大规模测定：文库中筛选阳性克隆，使用载体通用引物T3在MegaBACE1000测序仪上进行序列测定，将得到的原始峰图文件(*.abi，*.abd文件)数据经Phred程序处理转化为序列文件(*.seq)和质量文件(*.seq.qual)，依据质量文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用cross-mach程序屏蔽数据中的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于Q13(准确率大于95％)且长度大于100bp的序列作为EST数据，具体《基因表达序列标签(EST)数据分析手册》(胡松年著，浙江大学出版社，2005年)。

4.文蛤EST序列的同源性分析及多巴脱羧酶基因片段的筛选：将获得的全部有效的EST数据进行聚类拼接，生成Contigs和Singletons，分别将所获的Contigs与Singletons在数据库中进行BLASTn和BLASTx分析，结果显示在EST序列中发现了与菲律宾蛤仔(Venerupis philippinarum)，紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)和长牡蛎(Crassostrea gigas)多巴脱羧酶相似性较高的序列，根据相似性分析结果确定了文蛤多巴脱羧酶基因的EST序列。

5.文蛤多巴脱羧酶基因cDNA全长序列的克隆：根据与多巴脱羧酶基因同源的EST序列设计特异性引物F1和R1，分别利用载体通用引物T3和T7进行3’和5’末端的RACE扩增。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收试剂盒(Promega,USA)进行PCR产物的回收和纯化，再与pMD-18T载体(大连宝生物工程有限公司)连接，然后转化大肠杆菌感受态细胞Top10，挑选阳性克隆用载体引物M13-47和M13-48进行测序，所得结果经BioEdit软件拼接，得到文蛤多巴脱羧酶全长序列见SEQ ID NO.1。

所使用的引物序列如下：

F1：5’AAT CGG ACC AAT CTG TCA GG 3’

R1：5’CGT CTA AGT CTG GGT TCT CAG C 3’

T3：5’ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA 3’

T7：5’TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3’

6.文蛤多巴脱羧酶基因cDNA全长的验证：在测序拼接的多巴脱羧酶全长序列上设计一对引物F2和R2以cDNA为模板进行全长的验证。测序以及分析同步骤5.。

所使用的引物序列如下：

F2：5’AAT GTT AAG TGG ACT GAA CGG CA 3’

R2：5’AAT CCC TGA GTC CCA GTA AAT 3’

所述步骤5.中3’RACE扩增所用反应体系及反应条件：

25μl反应体系，包含：

扩增所用PCR反应程序：94℃变性4min，1个循环；94℃变性50s，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，1个循环；4℃保温。

所述步骤5.中5’RACE扩增所用反应体系及反应条件：

25μl反应体系，包含：

扩增所用PCR反应程序：94℃变性4min，1个循环；94℃变性50s，56℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，1个循环；4℃保温。

所述步骤6.中全长验证的PCR反应体系和反应条件为：

25μl反应体系，包含：

扩增所用PCR反应程序：94℃变性4min，1个循环；94℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，1个循环；4℃保温。

实施例2.文蛤多巴脱羧酶重组蛋白的获得

根据SEQ ID NO.1对应的编码框的cDNA序列，设计含有限制性内切酶BamH I和Sal I酶切位点的特异性引物BamH I-F和Sal I-R，通过PCR技术扩增编码多巴脱羧酶的基因片段，然后通过酶切将其克隆到pGEX-4T-1表达载体中，转化大肠杆菌BL21，测序确认表达框正确后，接种阳性克隆到含有氨苄青霉素(100mg/ml)的LB培养基中，37℃振荡培养至O.D.₆₀₀＝0.4-0.6，加入IPTG至终浓度为1mM诱导4小时后离心收集菌体。菌体在冰浴条件下用超声波200W处理30－60分钟(每次1秒，间隔1秒)。离心去掉上清，沉淀(含有重组蛋白包涵体)用Buffer A洗3次，Buffer B洗3次，然后加入10－20ml Buffer C在37℃摇床中震荡20－30min，溶解沉淀，将其转移到透析袋中，4℃条件下，在梯度尿素透析液(在下述所示的透析液中分别加入4M，2M或0M尿素依次透析)中透析，使重组蛋白复性。利用GE公司的GSTrap FF亲和柱纯化重组产物，得到文蛤多巴脱羧酶的GST重组蛋白，分子量约为为86.25kDa如附图1显示。

所使用的引物序列：

BamH I-F：5’ACG CGT CGA CTC ATG GAT GCA AGG GAA TTC AG GA 3’

Sal I-R：5’ATA AGA ATG CGG CCG CTT ACT TCC CAA CAA GAT GGC CAC3’

所用的溶液的组成：

Buffer A：50mM Tris-HCl，5mM EDTA，0.1％TritonX-100；

Buffer B：50mM Tris-HCl，5mM EDTA，2M尿素；

Buffer C：100mM Tris-HCl，10mM DTT，8M尿素；

透析液：100mM Tris-HCl，5mM EDTA，5mM半胱氨酸；

获得的文蛤多巴脱羧酶重组蛋白是多巴脱羧酶与GST的融合表达蛋白，其中多巴脱羧酶具有SEQ ID NO.2中所示的序列。

SEQ ID NO.2

MDAREFRKFGREMVDYIADYLENIRERPVVHRVKPGYLKTLIPDEAPQKPEDFSEVMKDIERVIMPGITHWHSPYFHGYYAAGNSFPSILGDMLSDTIGCIGFSWAASPACTELEMITTDWLGKMIGLPEQFLHCGKGKGGGVIQTTASETVFLCLLAARTKMVTKLKAENPDLDEMTIISKLVGYTSDQANSSVHRSGLLGAVTMVKLPSDENFSLQGKTLRQRIEKDKSEGKIPFFVCASLGTTGSCAFDNLEEIGPICQENDIWLHIDAAYAGSGFVCPEFRHYMKGIEYVQTFTINPHKWMLIAFDLSVLWIQDSSLLVDAFNVDPIYLRHENEGNVPDYRHWQIPLGRRFRALKLWFMLRSYGVEGVQKYIRHHCQLAHEFEKLVVDDGRFEIVTEVVMALVCFRLKGDNILSEKLLEEIVADGRLYLIPAIARDIYFLRLAVCAERTTSEDIRYSFVVIKSCTDKVMRRHIPLNDPKHKATIDIDISPKRLHGSSREDDLEDTCETMKGVNLNGDNANHGGHLVGK-

实施例3.文蛤多巴脱羧酶重组蛋白的ELISA检测

利用蛋白浓度测定试剂盒2-D Quant Kit(GE Healthcare,UK)对重组的多巴脱羧酶-GST融合蛋白进行浓度测定，然后采用多巴脱羧酶ELISA检测试剂盒(齐一生物科技(上海)有限公司)对文蛤多巴脱羧酶重组蛋白进行检测，检测其含有的多巴脱羧酶的含量，结果显示，每mg重组的多巴脱羧酶-GST融合蛋白含有约594pg的多巴脱羧酶。

实施例4.文蛤多巴脱羧酶重组蛋白对文蛤免疫增强效果检测

多巴脱羧酶参与神经内分泌免疫调节系统及黑化作用，对贝类可能具有免疫增强剂的作用。本实施例中，将文蛤分成两组，每组3个个体，一组注射上述实施例2中文蛤多巴脱羧酶重组蛋白透析后溶液(0.1ml,～20pg)和致病副溶血弧菌(0.1ml，～10⁷CFU/ml)，另一组注射0.1ml上述实施例中2的透析液和致病副溶血弧菌(0.1ml，～10⁷CFU/ml)作为对照，24小时后，抽取文蛤血淋巴并均匀涂布于弧菌培养基平板,30度培养箱培养20小时后菌落计数。结果(附图2)显示，注射多巴脱羧酶重组蛋白能有效降低感染文蛤体内的副溶血弧菌菌落数，重组多巴脱羧酶对文蛤有增强免疫的作用。

透析液：100mM Tris-HCl，5mM EDTA，5mM半胱氨酸。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院海洋研究所

<120> 文蛤多巴脱羧酶基因及其编码蛋白和应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1930

<212> DNA

<213> 人工设计

<220>

<221> gene

<222> (84)..(1683)

<223>

<400> 1

gtgcaaaagc caaatgttaa gtggactgaa cggcaaattg gacacaaaga atcacttact 60

tactggattt atttagagaa aaatggatgc aagggaattc aggaaatttg gtcgtgagat 120

ggtagactat attgctgatt atcttgaaaa cattagggag cgccccgttg tacacagggt 180

aaaaccaggg tacctaaaga cgttaatacc agacgaagcg cctcaaaaac ctgaagattt 240

ttctgaagta atgaaggata tagagagggt gataatgcct gggataactc actggcacag 300

tccgtatttt cacggctact atgccgctgg gaactcgttc ccctcgattc ttggagatat 360

gttgtctgat acaatcggat gcattggctt ttcatgggca gcgagtcctg catgtaccga 420

acttgaaatg atcacgacgg attggcttgg taaaatgata ggcctgcccg aacaattcct 480

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tctgtgttta ctggctgcca ggacgaaaat ggttacaaaa ctgaaagctg agaacccaga 600

cttagacgaa atgacaatca tatcaaagtt agtcggatat acctctgatc aggctaattc 660

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gaagtacatt cggcatcatt gtcagttggc tcatgaattc gaaaagctgg ttgttgacga 1260

cgggagattt gaaatcgtta cagaggttgt tatggcgctt gtttgcttcc gattaaaggg 1320

cgacaatatc ttgagtgaaa aattgctcga agaaatcgta gccgatggac gattgtactt 1380

gattcccgcc atagcacgcg acatctactt cctccgcttg gctgtatgcg cagaacgcac 1440

aacatccgag gacatccgat actcgttcgt tgtcataaaa tcctgcactg acaaagtgat 1500

gaggaggcat ataccactaa atgatccaaa acacaaggca accattgaca tcgacatatc 1560

cccaaaacgg cttcatggta gctccaggga agatgacctt gaagacacgt gtgaaactat 1620

gaagggtgtc aacctgaatg gagacaatgc taatcacggt ggccatcttg ttgggaagta 1680

atactaacaa gggagctatt gaatgaacga gtatgtgaac atcagggaat ttacgaaatt 1740

tactgggact cagggattta ttcaagggcc gtattctaat acaatatgcc gcaagtttgt 1800

gtgaatatat ttcgaacgtt ataattattt gactgtgatt aatttatgga aatctatttt 1860

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aaaaaaaaaa 1930