一种高亲和力IgE受体蛋白体外表达和分离纯化的方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种高亲和力IgE受体蛋白体外表达和分离纯化的方法。

背景技术：

慢性荨麻疹是皮肤科常见疾病之一，具有病因复杂，症状反复，病程长的特点，大部分患者找不到明确病因，而被认为是“特发性”，大约40％病程可超过10年，虽然不威胁生命，但是其带来的痛苦和烦恼及对工作和社会生活的影响甚至不亚于心脏疾患。深圳市每年发病人数超过1万人。对于相当一部分患者常规的抗过敏治疗(如抗组胺药物)往往不能奏效，这类患者属于自身免疫性慢性荨麻疹，血清中存在抗FcεR Iα(IgE受体)自身抗体或(和)抗IgE自身抗体，发病以自身免疫机制为基础。这些自身抗体可与肥大细胞及嗜碱性粒细胞表面的IgE受体FcεR的α链结合，并起到持续的炎症刺激作用，导致补体活化、患者肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒释放组胺。此类患者在规律使用抗过敏治疗3个月后无效改用免疫抑制治疗常常可获得一定疗效，但具有费时长、患者症状缓解慢、痛苦大等缺点。

现有的自体血清皮肤试验(autologous serum skin test,ASST)国际上称为Greaves试验，是筛选自身免疫性荨麻疹的临床应用检测方法。通常抽取患者外周血3ml，常温下离心分离血清，注入该被抽血者的前臂真皮内，同时，用等量生理盐水注入对侧真皮内作为对照。30分钟后观察注射处风团大小以进行判断。但是该方法在临床实施起来具有一定的难度，难以获得患者的配合。

利用抗原抗体反应，是一种很好的新方法来检测体内IgE受体蛋白自身抗体数量的方法，但此方法的前提是有高纯度大量的IgE受体蛋白。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种高亲和力IgE受体蛋白体外表达和分离纯化的方法。

为实现上述目的，本发明提出的高亲和力IgE受体蛋白体外表达和分离纯化的方法，包括如下步骤：将cDNA序列为SEQ ID NO:1的基因片段经过PCR扩增后，整合进大肠杆菌载体PET32M中，将构建成的载体转化至大肠杆菌BL21从而得到菌体；

将菌体置于37℃、200rad/min的摇床中培养至OD₆₀₀在0.6-0.8为止，然后加入IPTG使菌液中IPTG的浓度达到0.2mol/L，并继续在37℃，200rad/min的摇床条件下培养16h；将培养后的菌体依次经初步纯化、亲和层析、离子交换层析、凝胶层析分离纯化后得到高亲和力IgE受体蛋白。

进一步地，所述初步纯化是将培育后的菌体经4000g×20min离心后收取菌体，并悬置于20mL含50mM Tris-HCl，20mM NaCl的溶液中；超声破碎菌体，经18000g×20min离心后收取上清液。

进一步地，所述亲和层析纯化蛋白的方法为将所述上清液挂载镍离子亲和层析柱，并用清洗液清洗5个柱体积，洗脱液洗脱2个柱体积；其中，清洗液为50mM Tris-HCl，20mM NaCl，20mM咪唑的溶液；洗脱液为50mM Tris-HCl，20mM NaCl，200mM咪唑的溶液。

进一步地，所述离子交换纯化蛋白的方法为将所述洗脱液中蛋白置换缓冲液为低盐溶液，挂载离子交换层析柱，使用梯度洗脱的方法用高盐溶液将其洗脱下柱，低盐溶液为50mM Tris-HCl，20mM NaCl，高盐溶液为50mM Tris-HCl，1M NaCl。

进一步地，所述凝胶层析纯化蛋白的方法为将上述离子交换层析洗脱所得蛋白挂载凝胶层析柱中，使用缓冲液冲洗至其脱离层析柱，缓冲液为含50mM Tris-HCl，20mM NaCl的溶液。

进一步地，在经过凝胶层析纯化蛋白之前使用EK酶酶切蛋白，酶切溶液为50mM Tris-HCl，20mM NaCl的溶液。

本发明的分离纯化方法通过体外重组，借由大肠杆菌表达IgE高亲和力受体蛋白，而后使用亲和层析、凝胶层析和离子交换层析的方法分离纯化IgE高亲和力受体蛋白，进而得到纯IgE高亲和力受体蛋白。通过大肠杆菌实现可溶性表达，大大降低了IgE高亲和力受体蛋白成产生产成本和生产难度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为IgE高亲和力受体PCR产物的电泳检测图，其中fl为IgE高亲和力受体蛋白cDNA的PCR产物，M为marker；

图2为载体酶切图，其中fl为装入IgE高亲和力受体蛋白cDNA的质粒酶切结果，M为marker；

图3为IgE高亲和力受体蛋白最终纯化结果图，其中fl为IgE高亲和力受体蛋白，M为marker。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所述的高亲和力IgE受体蛋白体外表达和分离纯化的方法，包括如下步骤：

(1)构建菌体

将已知高亲和力IgE受体蛋白对应的cDNA序列为SEQ ID NO:1的基因片段经过PCR扩增后，整合进大肠杆菌载体PET32M中，通过测序验证载体构建正确后，将质粒按照碱裂解法抽提并转化表达大肠杆菌BL21，从而获得转化的菌体。如图1所示，基因片段经PCR扩增后电泳分析，fl为IgE高亲和力受体蛋白cDNA的PCR产物，M为marker。

(2)培养

将上述获得的菌体置于37℃、200rad/min的摇床中培养至OD₆₀₀在0.6-0.8为止，然后加入IPTG进行诱导，使菌液中IPTG的浓度达到0.2mol/L，并继续在37℃，200rad/min的摇床条件下培养16h。

(3)初步纯化

将培育后的菌体经4000g×20min离心后收取菌体，并悬置于20mL含50mM Tris-HCl，20mM NaCl的溶液中；超声破碎菌体，经18000g×20min离心后收取上清液。

(4)亲和层析

将所述上清液挂载在镍离子亲和层析柱上，并用清洗液清洗5个柱体积，再用洗脱液洗脱2个柱体积；其中，清洗液为50mM Tris-HCl，20mM NaCl，20mM咪唑的溶液；洗脱液为50mM Tris-HCl，20mM NaCl，200mM咪唑的溶液。

(5)离子交换层析

采用GE的Source 15Q填料，将层析柱首先采用低盐溶液作为蛋白置换缓冲液进行平衡，上样挂载离子交换层析柱，然后使用梯度洗脱的方法采用高盐溶液作为洗脱缓冲液将其洗脱下层析柱；其中，低盐溶液为50mM Tris-HCl，20mM NaCl，高盐溶液为50mM Tris-HCl，1M NaCl。

(6)凝胶层析

先使用EK酶酶切蛋白，酶切溶液为50mM Tris-HCl，20mM NaCl的溶液，再将上述离子交换层析洗脱所得蛋白挂载凝胶层析柱中，使用缓冲液冲洗至其脱离层析柱，最后得到高亲和力IgE受体蛋白。如图3所示，IgE高亲和力受体蛋白最终纯化结果图，其中fl为IgE高亲和力受体蛋白，M为marker。所述缓冲液为含50mM Tris-HCl，20mM NaCl的溶液。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。