一种高亲和力IgE受体蛋白体外表达和分离纯化的方法与流程

文档序号:12412092阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种高亲和力IgE受体蛋白体外表达和分离纯化的方法,其特征在于,包括如下步骤:将cDNA序列为SEQ ID NO:1的基因片段经过PCR扩增后,整合进大肠杆菌载体PET32M中,将构建成的载体转化至大肠杆菌BL21从而得到菌体;

将菌体置于37℃、200rad/min的摇床中培养至OD600在0.6-0.8为止,然后加入IPTG使菌液中IPTG的浓度达到0.2mol/L,并继续在37℃,200rad/min的摇床条件下培养16h;将培养后的菌体依次经初步纯化、亲和层析、离子交换层析、凝胶层析分离纯化后得到高亲和力IgE受体蛋白。

2.如权利要求1所述的高亲和力IgE受体蛋白体外表达和分离纯化的方法,其特征在于,所述初步纯化是将培育后的菌体经4000g×20min离心后收取菌体,并悬置于20mL含50mM Tris-HCl,20mM NaCl的溶液中;超声破碎菌体,经18000g×20min离心后收取上清液。

3.如权利要求2所述的高亲和力IgE受体蛋白体外表达和分离纯化的方法,其特征在于,所述亲和层析纯化蛋白的方法为将所述上清液挂载镍离子亲和层析柱,并用清洗液清洗5个柱体积,洗脱液洗脱2个柱体积;

其中,

清洗液为50mM Tris-HCl,20mM NaCl,20mM咪唑的溶液;

洗脱液为50mM Tris-HCl,20mM NaCl,200mM咪唑的溶液。

4.如权利要求3所述的高亲和力IgE受体蛋白体外表达和分离纯化的方法,其特征在于,所述离子交换纯化蛋白的方法为将所述洗脱液中蛋白置换缓冲液为低盐溶液,挂载离子交换层析柱,使用梯度洗脱的方法用高盐溶液将其洗脱下柱,

低盐溶液为50mM Tris-HCl,20mM NaCl,

高盐溶液为50mM Tris-HCl,1M NaCl。

5.如权利要求4所述的高亲和力IgE受体蛋白体外表达和分离纯化的方法,其特征在于,所述凝胶层析纯化蛋白的方法为将上述离子交换层析洗脱所得蛋白挂载凝胶层析柱中,使用缓冲液冲洗至其脱离层析柱,

缓冲液为含50mM Tris-HCl,20mM NaCl的溶液。

6.如权利要求5所述的高亲和力IgE受体蛋白体外表达和分离纯化的方法,其特征在于,在经过凝胶层析纯化蛋白之前使用EK酶酶切蛋白,酶切溶液为50mM Tris-HCl,20mM NaCl的溶液。

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