本发明涉及组织培养技术领域，尤其涉及一种丝棉木组织培养的培养基及方法。
背景技术：
金枝玉叶(Euonymus maackii Rupr.‘Jinzhi Yuye’)，是2003年张家勋、张丹同志在经过辐照后的丝棉木(Euonymus maackii)籽播苗中，发现的变异品种，经过3年的提纯、试种、改良和观察，现在变异品种的性状均已稳定。主要性状为：春、夏、秋三季枝条、叶片均为金黄色，经霜后枝条和叶片变为红色，落叶后枝条颜色越发鲜红，天气越冷颜色越红。其他习性与普通丝棉木一致。喜光，稍耐荫；耐寒，对土壤要求不严，耐干旱，也耐水湿，而以肥沃、湿润而排水良好之土壤生长最好。根系深而发达，能抗风；根蘖萌发力强。是一种优良的观叶观枝树种，可用于园林绿化，及庭院观赏树种，观赏价值高且容易养护。
繁殖可用播种、嫁接等方法。播种时间在3月中下旬至4月中上旬。采用条播，用犁开沟，沟深3至5厘米，行宽20至25厘米。将种子均匀撒入沟内，覆土厚度约1厘米，覆土后适当镇压。墒情适宜条件下20天左右出苗。嫁接一般在夏季进行，在温度高于30℃时，天气晴朗的时候，阴雨天会降低嫁接成活率。多采用芽接，选择生长健壮的芽，砧木选取丝绵木，在丝绵木树皮上划开‘T’型接口，将芽体接入，用塑胶条缠好。播种繁殖的成活率高，但是成苗较慢，嫁接成苗较快，但是需要较多的人工，对人工技术要求较高、受季节影响较大。为了保持母本的优良性状，且达到快速繁殖的目的，利用组培技术来实现金枝玉叶的快速繁殖。
但是目前并没有适用于金枝玉叶组织培养的培养基。因此，研发一种可提高金枝玉叶外植体增殖系数、丛生芽个数及生根率的组织培养的培养基具有重要的现实意义。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种丝棉木组织培养的培养基及方法，该培养基可提高金枝玉叶的外植体增殖系数、丛生芽个数及生根率。
本发明提供了一种诱导丝棉木丛生芽的培养基，其为含有0.5mg/L～1.0mg/L KT、0.05mg/L NAA、0.1mg/L～0.5mg/L TDZ、0.01mg/L赤霉素、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基，pH值为5.85。
本发明提供了一种诱导丝棉木丛生芽生根的培养基，其为含有0.1mg/L～0.5mg/L KT、0.03mg/L TDZ、10g/L～30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.80。
本发明提供了一种丝棉木组培苗炼苗的培养基，其为含有20g/L蔗糖和7g/L琼脂的WPM培养基，pH值为5.80。
MS培养基是适用于植物组织培养的培养基，其配方为NH4NO3 1.65g/L、KNO31.9g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KH2PO4 0.17g/L、KI 0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5mg/L、盐酸硫胺素(维生素B1)0.1mg/L、甘氨酸2mg/L，pH值为5.80。
1/2MS培养基是将MS培养基中大量元素、微量元素、有机物质、铁盐减半而蔗糖、琼脂量不变的培养基，其配方为：NH4NO3 0.825g/L、KNO30.95g/L、CaCl2·2H2O 0.22g/L、MgSO4·7H2O 0.185g/L、KH2PO4 0.085g/L、KI 0.415mg/L、H3BO3 3.1mg/L、MnSO4·4H2O 11.15mg/L、ZnSO4·7H2O 4.3mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.125mg/L、CuSO4·5H2O 0.0125mg/L、CoCl2·6H2O 0.0125mg/L、FeSO4·7H2O 13.9mg/L、Na2-EDTA·2H2O 18.65mg/L、肌醇50mg/L、烟酸0.25mg/L、盐酸吡哆醇(维生素B6)0.25mg/L、盐酸硫胺素(维生素B1)0.05mg/L、甘氨酸1mg/L，pH值为5.85。
WPM培养基是适用于木本植物的培养基，其配方为K2SO4 0.99g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KH2PO4 0.17g/L、NH4NO3 0.4g/L、MnSO4·4H2O 22.5mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.25mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、Ca(NO3)2·4H2O 0.556g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、维生素B6 0.5mg/L、维生素B1 0.1mg/L、维生素B5 0.5mg/L，pH值为5.80。
激动素(Kinetin，KT)是一种非天然的细胞分裂素，化学名称为6-糖基氨基嘌呤(或N6-呋喃甲基腺嘌呤)，除具有促进细胞分裂的作用外，还具有延缓离体叶片和切花衰老，诱导芽分化和发育及增加气孔开度的作用。
萘乙酸(1-Naphthylacetic acid，NAA)，是广谱型植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加座果，防止落果，改变雌、雄花比率等。可经叶片、树枝的嫩表皮，种子进入到植株内，随营养流输导到全株。
塞苯隆(thidiazuron，TDZ)，是一种新型高效的细胞分裂素用于组培能更好的促进植物的芽分化。
赤霉素(gibberellin，GA)，是广泛存在的植物激素。化学结构属于二萜类酸，由四环骨架衍生而得。赤霉素种类至少38种，应用于农业生产，可刺激叶和芽的生长，提高产量。本发明采用的是GA3。
本发明将上述4种激素以特定比例添加到基础培养基中，制得诱导丝棉木丛生芽的培养基、诱导丝棉木丛生芽生根的培养基和丝棉木组培苗炼苗的培养基，对金枝玉叶外植体进行组织培养时，可显著提高金枝玉叶的增殖系数、丛生芽发生率及生根率，效果好于现有报道的培养基种类。
一些实施例中，本发明提供了一种诱导丝棉木丛生芽的培养基，其为含有0.5mg/L KT、0.05mg/L NAA、0.1mg/L TDZ、0.01mg/L赤霉素、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基，pH值为5.85。
另一些实施例中，本发明提供了一种诱导丝棉木丛生芽的培养基，其为含有0.75mg/L KT、0.05mg/L NAA、0.3mg/L TDZ、0.01mg/L赤霉素、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基，pH值为5.85。
另一些实施例中，本发明提供了一种诱导丝棉木丛生芽的培养基，其为含有1mg/L KT、0.05mg/L NAA、0.5mg/L TDZ、0.01mg/L赤霉素、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基，pH值为5.85。
另一些实施例中，本发明提供了一种诱导丝棉木丛生芽的培养基，其为含有0.5mg/L KT、0.05mg/L NAA、0.1mg/L TDZ、0.01mg/L赤霉素、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基，pH值为5.85。
一些实施例中，本发明提供了一种诱导丝棉木丛生芽生根的培养基，其为含有0.1mg/L KT、0.03mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.80。
另一些实施例中，本发明提供了一种诱导丝棉木丛生芽生根的培养基，其为含有0.5mg/L KT、0.03mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.80。
另一些实施例中，本发明提供了一种诱导丝棉木丛生芽生根的培养基，其为含有0.3mg/L KT、0.03mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.80。
本发明提供的诱导丝棉木丛生芽的培养基、诱导丝棉木丛生芽生根的培养基、丝棉木组培苗炼苗的培养基所适用的丝棉木的品种为金枝玉叶。
本发明还提供了一种丝棉木的组织培养方法，包括如下步骤：
步骤1：将丝棉木外植体接种到所述诱导丝棉木丛生芽的培养基，培养至产生愈伤组织；
步骤2：所述愈伤组织接种至所述诱导丝棉木丛生芽生根的培养基，培养至分化出小苗；
步骤3：所述小苗转接到所述丝棉木组培苗炼苗培养基，培养后，经室外炼苗，得到丝棉木幼苗；
所述丝棉木的品种为金枝玉叶。
本发明中，外植体为金枝玉叶的枝条，经消毒后切成1～1.5cm的带腋芽的茎段。
本发明中，外植体获取的时间为每年4月中旬。
选取幼嫩无病虫害的枝条，采回后摘去叶片，作为外植体。
本发明中，消毒处理具体为：将金枝玉叶的枝条用水冲洗后，以NaClO溶液清洗，然后经酒精浸泡、HgCl溶液浸泡，再用水浸泡。
本发明中，所述用水冲洗的时间为45min；
所述NaClO溶液中NaClO的质量分数为0.1％；
所述酒精中乙醇的体积分数为75％，酒精浸泡的时间为90s；
所述HgCl溶液中HgCl的质量分数为0.1％，HgCl溶液浸泡的时间为2min；
所述用水浸泡的次数为6次，每次不短于3min。
用水冲洗时需用双层纱布包住外植体，在流水下冲洗45min。
所述NaClO溶液中含有吐温。每升NaClO溶液中加有1mL吐温80。
用水浸泡采用的水为无菌水。
外植体接种至诱导丝棉木丛生芽的培养基，该操作在无菌工作台(紫外灯杀菌15min)进行，器具(镊子、手术刀、接种盘)用体积分数为75％的酒精喷洒消毒。
外植体接种的容器为PP塑料组培瓶(500mL)，每瓶3个外植体。
步骤1～3中所述培养在组培室进行，本发明中，步骤1～步骤3中所述培养的光照周期为12h/d，光照强度为3500lx，培养温度为25℃，相对湿度为60％，每天用紫外灯灭菌15min。
外植体接种入诱导丝棉木丛生芽的培养基经15～45天，生出愈伤组织。
将遇上组织接种至诱导丝棉木丛生芽生根的培养基也在无菌工作台进行。经21～40天后愈伤组织分化出小苗，并长出须根。
将小苗接种至丝棉木组培苗炼苗培养基，培养30天后，室外炼苗获得丝棉木幼苗。
本发明中，步骤3中所述炼苗于室外进行。
在本发明提供的实施例中，炼苗为：取出组培苗，洗掉根部附着的培养基，晾干水分后栽植至培养土中，喷施含有多菌灵和代锌蒙森混合液，放置背光处，覆膜保湿，保持温度在15～20℃之间；待长出新叶后将苗挪至向阳处，并逐渐去掉覆膜，30d后转入正常养护。
本发明提供了适用于丝棉木新品种金枝玉叶的组织培养培养基，以1/2MS培养基为基础，添加KT、NAA、TDZ和赤霉素进行愈伤组织的诱导，以MS培养基为基础，添加KT和TDZ进行丛生芽的诱导，以WPM培养基作为炼苗培养基。在本发明提供培养基的诱导下，经诱导可使增值系数提高至9.72，幼苗成活率可达93％。
具体实施方式
本发明提供了一种丝棉木组织培养的培养基及方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：
1、生长环境
(1)采用固体培养基，其中琼脂质量浓度7g/L，蔗糖质量浓度30g/L，所配培养基经过高压高温蒸汽灭菌，温度126℃，5min。
(2)组培室，光照时间12h/d，光照强度3500lx，培养温度为25℃，相对湿度60％，每天用紫外灯灭菌15min。
2、金枝玉叶外植体的处理
(1)采取时，外植体的采取时间为4月中旬，选择幼嫩无病虫害的枝条。
(2)外植体采回后，摘去叶片。
(3)外植体用双层纱布包住，在流水下冲洗45min。
(4)后在加有数滴吐温的0.1％NaClO溶液中用细毛刷刷洗外植体。
3、无菌环境中消毒处理
(1)外植体在无菌工作台内用75％的酒精浸泡90s。
(2)后用0.1％HgCl消毒2min。
(3)消毒完成后，用无菌水冲洗6遍，每次浸泡时间要求长于3min。
4、接种工具的消毒
(1)镊子、手术刀、接种盘用75％的酒精喷洒消毒后，放入无菌工作台。
(2)无菌工作台，紫外灯打开15min再次进行表面杀菌。
(3)使用时，再用酒精灯进行高温消毒。
5、诱导丛生芽培养
(1)培养基为1/2MS+KT(激动素)0.5mg/L+NAA(萘乙酸)0.05mg/L+TDZ(噻苯隆)0.1mg/L+GA3(赤霉素)0.01mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH值为5.85。
(2)将消毒好的金枝玉叶枝条切成长1～1.5cm小段，接种到固体培养基中，每瓶3个外植体，共接种100个外植体。
6、诱导生根培养
(1)待长出大团愈伤组织，约15d，可将愈伤组织分开，转入到诱导丛生芽生根的培养基。
(2)生根的培养基配方为MS+KT(激动素)0.1mg/L+TDZ(噻苯隆)0.03mg/L+蔗糖10g/L+琼脂7g/L，pH值为5.80。
(3)35d愈伤组织分化出小苗，并长出3-5根须根。
7、炼苗培养基
小苗长出3-5根须根后，转入WPM+蔗糖20g/L+琼脂7g/L低盐固体培养基中，pH值为5.80，长30d后，进行炼苗，在外界环境中生长状况好，成苗率高达78％。
实施例2
1、生长环境
(1)采用固体培养基，其中琼脂质量浓度7g/L，蔗糖质量浓度30g/L，所配培养基经过高压高温蒸汽灭菌，温度126℃，5min。
(2)组培室，光照时间12h/d，光照强度3500lx，培养温度为25℃，相对湿度60％，每天用紫外灯灭菌15min。
2、金枝玉叶外植体的处理
(1)采取时，外植体的采取时间为4月中旬，选择幼嫩无病虫害的枝条。
(2)外植体采回后，摘去叶片。
(3)外植体用双层纱布包住，在流水下冲洗45min。
(4)后在加有数滴吐温的0.1％NaClO溶液中用细毛刷刷洗外植体。
3、无菌环境中消毒处理
(1)外植体在无菌工作台内用75％的酒精浸泡90s。
(2)后用0.1％HgCl消毒2min。
(3)消毒完成后，用无菌水冲洗6遍，每次浸泡时间要求长于3min。
4、接种工具的消毒
(1)镊子、手术刀、接种盘用75％的酒精喷洒消毒后，放入无菌工作台。
(2)无菌工作台，紫外灯打开15min再次进行表面杀菌。
(3)使用时，再用酒精灯进行高温消毒。
5、诱导丛生芽培养
(1)培养基为1/2MS+KT(激动素)0.75mg/L+NAA(萘乙酸)0.05mg/L+TDZ(噻苯隆)0.3mg/L+GA3(赤霉素)0.01mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH值为5.85。
(2)将消毒好的金枝玉叶切成长1-1.5cm小段，接种到固体培养基中，每瓶3个外植体，共接种100个外植体。
6、诱导生根培养
(1)待长出大团愈伤组织，约23d，可将愈伤组织分开，转入到诱导丛生芽生根的培养基。
(2)生根的培养基配方为MS+KT(激动素)0.3mg/L+TDZ(噻苯隆)0.03mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，pH值为5.80。
(3)40d愈伤组织分化出小苗，并长出1-3根须根。
7、炼苗培养基
小苗长出1-3根须根后，转入WPM+蔗糖20g/L+琼脂7g/L低盐固体培养基中，pH值为5.80，长30d后，进行炼苗，在外界环境中生长状况好，成苗率高达13％。
实施例3：
1、生长环境
(1)采用固体培养基，其中琼脂质量浓度7g/L，蔗糖质量浓度30g/L，所配培养基经过高压高温蒸汽灭菌，温度126℃，5min。
(2)组培室，光照时间12h/d，光照强度3500lx，培养温度为25℃，相对湿度60％，每天用紫外灯灭菌15min。
2、金枝玉叶外植体的处理
(1)采取时，外植体的采取时间为4月中旬，选择幼嫩无病虫害的枝条。
(2)外植体采回后，摘去叶片。
(3)外植体用双层纱布包住，在流水下冲洗45min。
(4)后在加有数滴吐温的0.1％NaClO溶液中用细毛刷刷洗外植体。
3、无菌环境中消毒处理
(1)外植体在无菌工作台内用75％的酒精浸泡90s。
(2)后用0.1％HgCl消毒2min。
(3)消毒完成后，用无菌水冲洗6遍，每次浸泡时间要求长于3min。
4、接种工具的消毒
(1)镊子、手术刀、接种盘用75％的酒精喷洒消毒后，放入无菌工作台。
(2)无菌工作台，紫外灯打开15min再次进行表面杀菌。
(3)使用时，再用酒精灯进行高温消毒。
5、诱导丛生芽培养
(1)培养基为1/2MS+KT(激动素)1.0mg/L+NAA(萘乙酸)0.05mg/L+TDZ(噻苯隆)0.5mg/L+GA3(赤霉素)0.01mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH值为5.85。
(2)将消毒好的金枝玉叶切成长1-1.5cm小段，接种到固体培养基中，每瓶3个外植体，共接种100个外植体。
6、诱导生根培养
(1)待长出大团愈伤组织，约45d，可将愈伤组织分开，转入到诱导丛生芽生根的培养基。
(2)生根的培养基配方为MS+KT(激动素)0.5mg/L+TDZ(噻苯隆)0.03mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH值为5.80。
(3)21d愈伤组织分化出小苗，并长出6-8根须根。
7、炼苗培养基
小苗长出6～8根须根后，转入WPM+蔗糖20g/L+琼脂7g/L低盐固体培养基中，pH值为5.80，长30d后，进行炼苗，在外界环境中生长状况好，成苗率高达71％。
实施例4
1、生长环境
(1)采用固体培养基，其中琼脂质量浓度7g/L，蔗糖质量浓度30g/L，所配培养基经过高压高温蒸汽灭菌，温度126℃，5min。
(2)组培室，光照时间12h/d，光照强度3500lx，培养温度为25℃，相对湿度60％，每天用紫外灯灭菌15min。
2、金枝玉叶外植体的处理
(1)采取时，外植体的采取时间为4月中旬，选择幼嫩无病虫害的枝条。
(2)外植体采回后，摘去叶片。
(3)外植体用双层纱布包住，在流水下冲洗45min。
(4)后在加有数滴吐温的0.1％NaClO溶液中用细毛刷刷洗外植体。
3、无菌环境中消毒处理
(1)外植体在无菌工作台内用75％的酒精浸泡90s。
(2)后用0.1％HgCl消毒2min。
(3)消毒完成后，用无菌水冲洗6遍，每次浸泡时间要求长于3min。
4、接种工具的消毒
(1)镊子、手术刀、接种盘用75％的酒精喷洒消毒后，放入无菌工作台。
(2)无菌工作台，紫外灯打开15min再次进行表面杀菌。
(3)使用时，再用酒精灯进行高温消毒。
5、诱导丛生芽培养
(1)培养基为1/2MS+KT(激动素)0.5mg/L+NAA(萘乙酸)0.05mg/L+TDZ(噻苯隆)0.1mg/L+GA3(赤霉素)0.01mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH值为5.85。
(2)将消毒好的金枝玉叶切成长1-1.5cm小段，接种到固体培养基中，每瓶3个外植体，共接种100个外植体。
6、诱导生根培养
(1)待长出大团愈伤组织，约15d，可将愈伤组织分开，转入到诱导丛生芽生根的培养基。
(2)生根的培养基配方为MS+KT(激动素)0.5mg/L+TDZ(噻苯隆)0.03mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH值为5.80。
(3)21d愈伤组织分化出小苗，并长出6-8根须根。
7、炼苗培养基
小苗长出6-8根须根后，转入WPM+蔗糖20g/L+琼脂7g/L低盐固体培养基中，pH值为5.80，长30d后，进行炼苗，在外界环境中生长状况好，成苗率高达93％。
实施例5
实施例1～4外植体接种3周后进行观察，记录芽分化状况。统计外植体的芽数、叶色、丛生芽情况如下表：
表1丛生芽增值情况表
实施例1～4接种金枝玉叶外植体后，1周后实施例1径段下方形成一圈愈伤组织，实施例2径段下无反应，实施例3径段下无反应，实施例4产生黄色的愈伤组织；
2周后实施例1径段下方形成一团愈伤组织，实施例2径段无愈伤组织，径段上方开始干枯，实施例3径段下方膨大，实施例4的愈伤组织开始分化，能看到有叶片长出；
3周后实施例1的愈伤组织长出丛生芽，实施例2径段有部分芽开始分化，实施例3径段下方分化出愈伤组织，实施例4的愈伤组织分化出大量的丛生芽，叶子嫩黄色。
实施例6
实施例1～4诱导产生的丛生芽分开接到各自的生根培养基中，生长4周后，记录生根情况。各实施例生根培养基接种后丛生芽的生根情况、生根数、成苗数如表2。
表2丛生芽生根情况表
三个培养基配方接种金枝玉叶后，4周后：
实施例1接种的丛生芽长大，成为小苗，在小苗的下端直接分化出须根，4周后生根率34.2％，平均生根数3.2，须根白色；
实施例2接种的丛生芽生长较旺盛，但径段下部并无须根产生，由于叶片生长较旺盛，消耗过多的养分，且无须根的产生，叶片开始泛黄枯萎；
实施例3接种的丛生芽长大，成为小苗，在小苗的下端直接分化出须根，4周后生根率21.3％，平均生根数2.4，须根白色；
实施例4接种的丛生芽分化长成小苗，叶片黄绿色，生根率95.4％，平均生根数5.7，须根根尖白色，靠近径段部分褐色。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。