本发明涉及微生物转化提取植物有效成分的技术领域，具体地说，是提供一种从化橘红叶原料中转化和制备柚皮素和芹菜素的方法。
背景技术：
柚皮素属二氢黄酮类化合物，它是柚皮苷的苷元，白色针状结晶，熔点260℃，溶于乙醇、乙醚和苯，几乎不溶于水，分子式为C15H12O5，分子量为272.25，结构式如式1所示。具有抗菌、抗炎、抗氧化、止咳祛痰、降血脂、抗肿瘤、利胆、预防和治疗肝病、抑制血小板凝结等作用，可被广泛地应用于医药、食品等领域。
目前，制备柚皮素的方法主要有两种：1、提取法，即从含有柚皮素的植物原料中通过特定工艺流程进行提取，由于天然植物材料中含量低，提取分离工艺复杂，因此，收率低且三废排放量大。2、水解法，即以柚皮苷作为反应物，通过对反应物进行水解反应制备柚皮素。水解法主要包括酶解法和酸水解法。酶解法是以提取得到的柚皮苷为底物，用由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶组成混合柚苷酶催化水解，产物为柚皮素、鼠李糖和葡萄糖，但柚苷酶造价高，易失活，效率低，成本高。酸水解法一般采用硫酸水解柚皮苷得到柚皮素，但该方法所得到的柚皮素需要用乙醇反复结晶才能得到高纯度柚皮素，有机溶媒进行酸水解也增加了成本和操作复杂程度。
芹菜素属黄酮类化合物，几乎不溶于水，部分溶于热酒精，溶于稀KOH 溶液。分子式：C15H10O5 ，分子量：270.24，熔点345～350℃，结构式如式2所示。来源于伞形科植物旱芹叶，具有抑制致癌物质的致癌活性，作为治疗HIV和其它病毒感染的抗病毒药物，治疗各种炎症，具有抗氧化、镇静、安神和降压等作用。
目前，国内外制备芹菜素有两种方式：天然提取和半合成。天然的含量很低，提取工艺复杂，效率低。半合成是从柚皮苷分解得到柚皮素再脱氢得到芹菜素。以柚皮苷为原料要经过两步反应才能制备，过程复杂，而且碘的用量较大。
化橘红叶中含有丰富的黄酮柚皮苷和野漆树苷（二者占叶干物质6～13.6%），并同时含有少量的柚皮素和芹菜素（二者占叶干物质0.1～0.6%），柚皮苷和野漆树苷具有延缓衰老、防腐、抗菌、抗氧化等功效，通常情况下黄酮苷是通过体内分解成苷元而起到生理作用，苷元比其苷有更强的生理活性，因此，把黄酮苷转化成其苷元能提高中药药效。通过微生物使化橘红叶黄酮苷转化，提高药材中的苷元含量，或分别制备柚皮素和芹菜素，能有效地提高化橘红的利用价值。化橘红营养生长速度快，年抽稍3～5次，枝叶产量巨大，目前广东化州市及周边地区化橘红种植面积约20万亩，并以每年增加1万亩的速度扩大种植规模，因此，化橘红叶类黄酮的资源供应充足。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种通过微生物转化化橘叶黄酮制备柚皮素和芹菜素的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种通过微生物转化化橘叶黄酮制备柚皮素和芹菜素的方法，具体步骤如下：
1. 一种通过微生物转化化橘红叶黄酮制备柚皮素和芹菜素的方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）采摘化橘红嫩叶洗净，太阳晒干或置于烘箱中50～60℃烘干至恒重，粉碎过60～80目筛，得到化橘红嫩叶粉末，备用；
（2）取化橘红嫩叶粉末，用蒸馏水湿润，充分搅匀，分别放置在培养皿中，敞开，置于温度为25～30℃、湿度为75～95％的培养箱中培养72～96h，自然生长繁殖的细菌或霉菌作菌种；
（3）取细菌、霉菌制成悬浮液，接种于马铃薯液体培养基中，30~40℃、180~250 rpm 培养48~72 h，得种子菌培养液；
（4）取化橘红叶粉末加入适量水，搅拌均匀制成转化培养基，加入上述培养的种子菌培养液，搅拌均匀，在搪瓷托盘中铺平，置于温度为30～40℃，湿度为75～95%生化培养箱培养48～96h；
（5）将经过转化的培养基置于100～110℃下进行加热以终止发酵，后调节温度至50～60℃进行烘干，粉碎过70～90目筛，得到菌丝和培养基混合粉末；
（6）将所得的混合粉末装入玻璃层析柱中，用95%的乙醇作为洗脱液提取，收集2倍体积的洗脱液；
（7）将洗脱液经减压浓缩回收乙醇，浓缩液转移并用蒸馏水洗涤合并到分液漏斗，加入等量体积石油醚萃取3次，去除上层液，得到下层含有柚皮素和芹菜素混合液；
（8）将所得的含有柚皮素和芹菜素混合液，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，旋转蒸发减压浓缩，得到柚皮素和芹菜素粗产品，所得浸膏用甲醇复溶，过滤，除去沉淀，滤液旋干备用；
（9）将所得的粗产品经D101大孔树脂分离纯化，首先用蒸馏水预洗除杂，再用2%KOH 水溶液洗去色素，然后依次用不同浓度的乙醇溶液进行洗脱，用紫外吸收光谱和高效液相跟踪检测，分别收集两组分含量最高的洗脱液，减压浓缩，分别得到柚皮素和芹菜素。
作为本发明进一步的方案：所述的种子菌培养基，其成分包括马铃薯、化橘红果实粉末和水分，配制方法：将煮熟马铃薯150g磨成浆，加入化橘红果实细粉末50g，摇匀，定容到1000mL。所述的转化培养基是用适量的水湿润嫩叶粉末制成。
作为本发明进一步的方案：所述步骤（8）中，在用KOH 水溶液水洗后，分别用体积分数为4BV/h的20%乙醇、2BV/h的30%乙醇、2BV/h的40%乙醇、2BV/h的50%乙醇、2BV/h的60%的乙醇、4BV/h的70%乙醇进行洗脱。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明方法不需要分别提取柚皮苷和野漆树苷，而是直接利用微生物转化化橘红叶中同时存在的柚皮苷和野漆树苷底物。本发明的条件温和，方法简单易操作，成本低，避免了酸水解带来的污染问题，由于菌种取于自然生长在化橘红枝条或果实上的，因而具有专一性强、转化率高的优点，制备的柚皮素和芹菜素纯度可达98% 以上。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
采摘化橘红嫩叶洗净，太阳晒干或置烘箱中60℃烘干至恒重，粉碎过80目筛备用。取叶粉末100 g，用蒸馏水适量，湿润，充分搅匀，分盛在直径12cm的培养皿中，敞开，置温度25℃，湿度85%培养箱中培养72h，自然生长繁殖的细菌或霉菌作菌种。将煮熟马铃薯150g磨成浆，加入化橘红果实粉末50g，摇匀，用水定容到1000mL，制成马铃薯种子菌培养基。取上述菌种2 g (含培养基)接种于500mL马铃薯液体种子菌培养基中，30℃、180 rpm 培养60 h，得种子菌培养液。
取化橘红叶粉末1000g加3000mL水，搅匀，即成转化培养基，加入上述培养的种子菌液250mL，搅拌均匀，分装在4个20*30cm型搪瓷托盘，铺平，置于温度35℃，湿度75%生化培养箱培养72小时；转化培养基置105℃温度下加热2h以终止发酵，后调节温度65℃烘干，粉碎过80目筛，混合粉末装入直径为8cm玻璃层析柱中，用95%的乙醇作为洗脱液提取，收集2倍体积（mL/g）即2000mL洗脱液，洗脱液经减压浓缩回收乙醇，浓缩液转移并用少量水洗合并约100mL到分液漏斗。每次加入等量体积石油醚萃取3次，去除上层液（含叶色素），得到下层含有柚皮素和芹菜素混合液。用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，旋转蒸发减压浓缩得到柚素和芹菜素粗产品，所得浸膏用甲醇复溶，过滤，除去沉淀，滤液用水稀释到200mL。
选取直径为8 cm玻璃层析柱，装入预处理好的大孔吸附树脂D101，将上述样液注入层析柱中，上样流速3 mL/min，上样量200mL，等样液完全渗透到树脂后，首先用5 BV/h 蒸馏水预洗除杂，再用2BV/h 2%KOH 水溶液洗去残余色素，然后依次用体积分数为4BV/h的20%乙醇、2BV/h 30%乙醇、2BV/h 40%乙醇、2BV/h 50% 乙醇、2BV/h 60% 、4BV/h 70% 乙醇洗脱，每收集小管收集10mL，紫外吸收光谱和高效液相跟踪检测，分别合并两组份含量最高的前后共5支收集管洗脱液，旋转蒸发，至无乙醇，分别得到柚皮素和芹菜素。转化与分离纯化结果见表1。
表1 化橘红叶类黄酮物质微生物转化前后的含量及苷元的回收率
实施例2
采摘化橘红嫩叶洗净，太阳晒干或置烘箱中60℃烘干至恒重，粉碎过80目筛备用。取叶粉末100 g，加蒸馏水200mL，湿润，充分搅匀，分盛在直径12 cm的培养皿中，敞开，置温度25℃，湿度95%培养箱中培养96小时，得到种子菌。将煮熟马铃薯150g磨成浆，加入化橘红果实粉末50g，摇匀，用水定容到1000mL，制成马铃薯种子菌培养基。取上述菌种3 g (含培养基)接种于500mL马铃薯液体种子菌培养基中，35℃、220 rpm 培养48 h，得种子菌培养液。
取化橘红叶粉末1000g加3500mL水，搅匀，即成转化培养基，加入上述培养的种子菌液200mL，搅拌均匀，分装在4个20*30cm型搪瓷托盘，铺平，置于温度35℃，湿度95%生化培养箱培养60小时；转化培养基置100℃1小时终止发酵，后调节温度65℃烘干，粉碎过80目筛，混合粉末装入直径为8cm玻璃层析柱中，用95%的乙醇作为洗脱液提取，收集2倍体积（mL/g）即2000mL洗脱液，洗脱液经减压浓缩回收乙醇，浓缩液转移并用少量水洗合并约100mL到分液漏斗。每次加入等量体积石油醚萃取3次，去除上层液（含叶色素），得到下层含有柚皮素和芹菜素混合液。用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，旋转蒸发减压浓缩得到柚皮素和芹菜素粗产品，所得浸膏用甲醇复溶，过滤，除去沉淀，滤液用水稀释到200mL。
选取直径为8cm玻璃层析柱，装入预处理好的D101大孔吸附树脂，将上述样液注入层析柱中，上样流速3 mL/min，上样量200mL，等样液完全渗透到树脂后，首先用5 BV/h 蒸馏水预洗除糖，再用2 BV/h 2%KOH 水溶液洗去残余色素，然后依次用4 BV/h 20% 乙醇、4 BV/h 40% 乙醇、4 BV/h 60% 、4 BV/h 70% 乙醇洗脱，每收集小管收集10 mL，紫外吸收光谱和高效液相跟踪检测，分别合并两组份含量最高的前后共5支收集管洗脱液，旋转蒸发，至无乙醇，分别得到柚皮素和芹菜素。转化与分离纯化结果见表2。
表2 化橘红叶类黄酮物质微生物转化前后的含量及苷元的回收率
实施例3
采摘化橘红嫩叶洗净，太阳晒干或置烘箱中60℃烘干至恒重，粉碎过80目筛备用。取叶粉末100 g加200mL，湿润，充分搅匀，分盛在直径12 cm的培养皿中，敞开，置温度35℃，湿度95%的培养箱中培养84h，得到种子菌。将煮熟马铃薯150g磨成浆，加入化橘红果实粉末50g，摇匀，用水定容到1000mL，制成马铃薯种子菌培养基。取上述菌种3 g (含培养基)接种于500mL马铃薯液体种子菌培养基中，40℃、250 rpm 培养72 h，得种子菌培养液。
取化橘红叶粉末1000g加4000mL水，搅匀，即成转化培养基，加入上述培养的种子菌液250mL，搅拌均匀，分装在4个20*30cm型搪瓷托盘，铺平，置于温度30℃，湿度85%生化培养箱培养96小时；发酵培养基置于110℃温度下加热0.5h以终止发酵，后调节温度60℃烘干，粉碎过80目筛，混合粉末装入直径为8cm玻璃层析柱中，用95%的乙醇作为洗脱液提取，收集2倍体积（mL/g）即2000mL洗脱液，洗脱液经减压浓缩回收乙醇，浓缩液转移并用少量水洗合并约100mL到分液漏斗。每次加入等量体积石油醚萃取3次，去除上层液（含叶色素），得到下层含有柚皮素和芹菜素混合液。用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，旋转蒸发减压浓缩得到柚皮素和芹菜素粗产品，所得浸膏用甲醇复溶，过滤，除去沉淀，滤液用水稀释到200mL。
选取直径为8cm玻璃层析柱，装入预处理好的大孔吸附树脂D101，将上述样液注入层析柱中，上样流速3mL/min，上样量200mL，等样液完全渗透到树脂后，首先用5 BV 蒸馏水预洗除糖，再用2BV 2%KOH 水溶液洗去残余色素，然后依次用4BV 20% 乙醇、4BV 40% 乙醇、4BV 60% 、4BV 70% 乙醇洗脱，每收集小管收集10mL，紫外吸收光谱和高效液相跟踪检测，分别合并两组份含量最高的前后共5支收集管洗脱液，旋转蒸发，至无乙醇，分别得到柚皮素和芹菜素。转化与分离纯化结果见表3。
表3 化橘红叶类黄酮物质微生物转化前后的含量及苷元的的纯化回收率
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。