一种斑马鱼胚胎急性毒性实验的试剂盒的制作方法

本发明涉及斑马鱼胚胎急性毒性毒性检测
技术领域：
，具体地涉及一种斑马鱼胚胎急性毒性实验的试剂盒。
背景技术：
：斑马鱼是一种常见的热带鱼。斑马鱼体型纤细，成体长3-4cm，对水质要求不高。孵出后约3个月达到性成熟，成熟鱼每隔几天可产卵一次。卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。发育温度要求在25～31℃之间。斑马鱼由于个体小，养殖花费少，能大规模繁育，且具许多优点，吸引了众多研究者的注意。经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库里有相关的资料可供查询和下载，方便了研究。斑马鱼由于养殖方便、繁殖周期短、产卵量大、胚胎体外受精、体外发育、胚体透明，已成为生命科学研究的新宠。全球范围内有超过1500个斑马鱼实验室。利用斑马鱼，可以研究生命科学的基础问题，揭示胚胎和组织器官发育的分子机理；可以构建人类的各种疾病和肿瘤模型，建立药物筛选和治疗的研究平台；可以建立毒理学和水产育种学模型，研究和解决环境科学和农业科学的重大问题。斑马鱼的基因与人类基因相似度达到87％，这意味着在它身上得出的水质监测结果，多数情况下都适用于人类。因此对于某些毒性物质的反应也能更好与对人体的毒性反应类似，以试验样品浓度和相应浓度下斑马鱼胚胎的死亡率或畸形率为基础建立正相关关系，并根据未添加试验样品的斑马鱼胚胎为参考，通过恒温培养来快速的测出样品的急性毒性，因此如果能结合此原理快速测定物质毒性，直观的表征方便快速的判断，进行安全性评估，建立早期、灵敏及高通量筛选的急性毒预防系统，为进一步研发提供基础数据和实验依据。技术实现要素：本发明的目的是提供一种斑马鱼胚胎急性毒性实验的试剂盒，设计科学、结果准确、使用方便，检测效率高。本发明的技术方案为：一种斑马鱼胚胎急性毒性实验的试剂盒，试剂盒主要包括盒体和遮光盖，所述的盒体内设置有胚胎培养卡槽、测试瓶卡槽、吸管、营养供给卡槽，所述的胚胎培养卡槽内置有胚胎瓶和培养液瓶，所述的胚胎瓶内盛放斑马鱼胚胎，所述的测试瓶卡槽内放置有多个测试瓶，测试瓶内装有待测溶剂及对比实验溶剂，所述的测试瓶包括24孔培养液瓶和培养皿，所述的培养液瓶和培养皿之间设有吸管。进一步的，所述的试剂盒的制备方法主要包括以下步骤：a.挑选适宜的斑马鱼进行培养，收集斑马鱼胚胎，制成胚胎瓶；b.制备胚胎培养液；c.制备试剂盒盒体，并将胚胎培养卡槽、测试瓶卡槽、吸管、营养供给卡槽进行生产组装，即得到所述的斑马鱼胚胎急性毒性实验的试剂盒。进一步的，所述的胚胎瓶制备方法为：选择游动和体色均正常，摄食无异常的4-5月龄的健康性成熟的斑马鱼按照雌比例为雄为1：1.5-2的比例放入交配容器内，并在交配容器内设置围挡，在25-30℃的环境下自然交配24-36小时，在交配过程中自然交配并收集受精卵三次，将三次收集到的受精卵使用胚胎培养液清洗，并去除杂质和坏卵，之后置于胚胎培养液中并放入恒温培养箱中，25-30℃下静置控光培养，通过光控系统，保持光照14h/黑暗10h交替的光照周期，当2-4hpf时，在显微镜下挑选来自同一亲本、正常发育比率达90％以上且发育时期一致的斑马鱼胚胎，然后加入胚胎瓶中，每瓶的加入量为20只，斑马鱼4月龄进入性成熟期，一月内繁殖效率较高。进一步的，所述的收集受精卵的时间为次日的9-10时，斑马鱼一般在黎明到第二天上午10时左右产卵结束。进一步的，所述的胚胎培养液制备方法为：用pH为7.2-8.5的弱碱性水直接配制，胚胎培养液中含有NaCl5.5mM，KCl0.18mM，CaCl20.35mM，MgSO40.35mM，使用1.5M的NaHCO3调节pH至7.0-7.2；由NaCl饱和溶液调节电导率在500-550μs；培养液配制水温维持在25-30℃。进一步的，所述的吸管为巴氏吸管，两端开口，管的一端拉细，内径较小。进一步的，所述的试剂盒的使用方法为：在25-30℃的环境下，将胚胎瓶中的斑马鱼胚胎用胚胎培养液清洗两遍，移取胚胎至加有胚胎培养液的培养皿中，每孔5-10胚胎，将待测溶剂及对比实验溶剂分别装入20孔板的测试瓶中，打开吸管，将待测溶剂及对比实验溶剂分别吸入对应的胚胎培养皿中，将培养皿放入恒温培养箱内进行培养，然后在12-24小时观察记录斑马鱼胚胎发育的畸形率和死亡率，通过判断和对比来确定待测溶剂的急性毒性。进一步的，所述的待测溶剂是将待测物溶解在去离子水中制成的质量浓度大于50％的溶剂，添加量为3-5ml；所述的对比实验溶剂为所述的去离子水，添加量为3-5ml。进一步的，所述的恒温培养箱是通过水介质液体和位于水介质液体中的电热管来水浴恒温加热的，所述电热管为设于壳体内部底部的蛇形管，在水浴部分设置有恒温培养槽和温度传感器，所述的温度传感器设于培养槽外侧，通过控温系统实施检测温度并循环加热使温度保持在恒定范围，所述恒温培养装置的尺寸为长×宽×高为500mm×300mm×200mm，所述的恒温培养槽的尺寸为长×宽×高为240mm×150mm×100mm。与现有技术相比，本发明的试剂盒的有益效果体现在：该试剂盒是将优选的斑马鱼健康胚胎直接进行急性毒性检测，过程简单，易操作，不易受外界其他因素影响，提高定性检测效率，压缩检测数据，节省检测时间，应用范围广，待测物质不仅仅局限于水质等其他液体，固体或不同状态的物质也可以使用。附图说明图1是本发明的一种斑马鱼胚胎急性毒性实验的试剂盒的外部结构示意图；图2是本发明的一种斑马鱼胚胎急性毒性实验的试剂盒的内部结构示意图；其中，1-盒体，2-遮光盖，3-培养液瓶，4-胚胎瓶，5-培养皿，24孔培养液瓶6，7-营养供给卡槽，8-测试瓶卡槽，9-吸管。具体实施方式为便于对本发明的理解，下面将结合具体实施例为例做进一步的解释说明，实施例并不构成对本发明实施例的限定。实施例1：一种斑马鱼胚胎急性毒性实验的试剂盒，主要包括盒体1和遮光盖2，盒体1内设置有胚胎培养卡槽、测试瓶卡槽8、吸管9、营养供给卡槽7，胚胎培养卡槽内置有胚胎瓶4和培养液瓶3，胚胎瓶4内盛放斑马鱼胚胎，测试瓶卡槽8内放置有多个测试瓶，测试瓶内装有待测溶剂及对比实验溶剂，测试瓶包括24孔培养液瓶6和培养皿5，培养液瓶6和培养皿5之间设有吸管9。试剂盒的制备方法主要包括以下步骤：a.挑选游动和体色均正常，摄食无异常的4月龄的健康性成熟的斑马鱼按照雌比例为雄为1：1.5的比例放入交配容器内，并在交配容器内设置围挡，在25℃的环境下自然交配24小时，在交配过程中自然交配并收集受精卵三次，将三次收集到的受精卵使用胚胎培养液清洗，并去除杂质和坏卵，之后置于胚胎培养液中并放入恒温培养箱中，25℃下静置控光培养，通过光控系统，保持光照14h/黑暗10h交替的光照周期，当2hpf时，在显微镜下挑选来自同一亲本、正常发育比率达90％以上且发育时期一致的斑马鱼胚胎，然后加入胚胎瓶中，每瓶的加入量为20只，斑马鱼4月龄进入性成熟期，一月内繁殖效率较高，收集受精卵的时间为次日的9时，斑马鱼一般在黎明到第二天上午10时左右产卵结束，收集斑马鱼胚胎，制成胚胎瓶4；b.用pH为7.2的弱碱性水直接配制胚胎培养液，其中含有NaCl5.5mM，KCl0.18mM，CaCl20.35mM，MgSO40.35mM，使用1.5M的NaHCO3调节pH至7.0；由NaCl饱和溶液调节电导率在500μs；培养液配制水温维持在25℃；c.制备试剂盒盒体1，并将胚胎培养卡槽、测试瓶卡槽8、吸管9、营养供给卡槽7进行生产组装，吸管为巴氏吸管，两端开口，管的一端拉细，内径较小,即得到斑马鱼胚胎急性毒性实验的试剂盒。实施例2：一种斑马鱼胚胎急性毒性实验的试剂盒，主要包括盒体1和遮光盖2，盒体1内设置有胚胎培养卡槽、测试瓶卡槽8、吸管9、营养供给卡槽7，胚胎培养卡槽内置有胚胎瓶4和培养液瓶3，胚胎瓶4内盛放斑马鱼胚胎，测试瓶卡槽8内放置有多个测试瓶，测试瓶内装有待测溶剂及对比实验溶剂，测试瓶包括24孔培养液瓶6和培养皿5，培养液瓶6和培养皿5之间设有吸管9。试剂盒的制备方法主要包括以下步骤：a.挑选游动和体色均正常，摄食无异常的4.5月龄的健康性成熟的斑马鱼按照雌比例为雄为1：1.8的比例放入交配容器内，并在交配容器内设置围挡，在27.5℃的环境下自然交配30小时，在交配过程中自然交配并收集受精卵三次，将三次收集到的受精卵使用胚胎培养液清洗，并去除杂质和坏卵，之后置于胚胎培养液中并放入恒温培养箱中，27.5℃下静置控光培养，通过光控系统，保持光照14h/黑暗10h交替的光照周期，当3hpf时，在显微镜下挑选来自同一亲本、正常发育比率达90％以上且发育时期一致的斑马鱼胚胎，然后加入胚胎瓶中，每瓶的加入量为20只，斑马鱼4月龄进入性成熟期，一月内繁殖效率较高，收集受精卵的时间为次日的9.5时，斑马鱼一般在黎明到第二天上午10时左右产卵结束，收集斑马鱼胚胎，制成胚胎瓶4；b.用pH为7.8的弱碱性水直接配制胚胎培养液，其中含有NaCl5.5mM，KCl0.18mM，CaCl20.35mM，MgSO40.35mM，使用1.5M的NaHCO3调节pH至7.1；由NaCl饱和溶液调节电导率在525μs；培养液配制水温维持在27.5℃；c.制备试剂盒盒体1，并将胚胎培养卡槽、测试瓶卡槽8、吸管9、营养供给卡槽7进行生产组装，吸管为巴氏吸管，两端开口，管的一端拉细，内径较小。即得到斑马鱼胚胎急性毒性实验的试剂盒。实施例3：一种斑马鱼胚胎急性毒性实验的试剂盒，主要包括盒体1和遮光盖2，盒体1内设置有胚胎培养卡槽、测试瓶卡槽8、吸管9、营养供给卡槽7，胚胎培养卡槽内置有胚胎瓶4和培养液瓶3，胚胎瓶4内盛放斑马鱼胚胎，测试瓶卡槽8内放置有多个测试瓶，测试瓶内装有待测溶剂及对比实验溶剂，测试瓶包括24孔培养液瓶6和培养皿5，培养液瓶6和培养皿5之间设有吸管9。试剂盒的制备方法主要包括以下步骤：a.挑选游动和体色均正常，摄食无异常的5月龄的健康性成熟的斑马鱼按照雌比例为雄为1：2的比例放入交配容器内，并在交配容器内设置围挡，在30℃的环境下自然交配36小时，在交配过程中自然交配并收集受精卵三次，将三次收集到的受精卵使用胚胎培养液清洗，并去除杂质和坏卵，之后置于胚胎培养液中并放入恒温培养箱中，30℃下静置控光培养，通过光控系统，保持光照14h/黑暗10h交替的光照周期，当4hpf时，在显微镜下挑选来自同一亲本、正常发育比率达90％以上且发育时期一致的斑马鱼胚胎，然后加入胚胎瓶中，每瓶的加入量为20只，斑马鱼4月龄进入性成熟期，一月内繁殖效率较高，收集受精卵的时间为次日的10时，斑马鱼一般在黎明到第二天上午10时左右产卵结束，收集斑马鱼胚胎，制成胚胎瓶4；b.用pH为8.5的弱碱性水直接配制胚胎培养液，其中含有NaCl5.5mM，KCl0.18mM，CaCl20.35mM，MgSO40.35mM，使用1.5M的NaHCO3调节pH至7.2；由NaCl饱和溶液调节电导率在550μs；培养液配制水温维持在30℃；c.制备试剂盒盒体1，并将胚胎培养卡槽、测试瓶卡槽8、吸管9、营养供给卡槽7进行生产组装，吸管为巴氏吸管，两端开口，管的一端拉细，内径较小。即得到斑马鱼胚胎急性毒性实验的试剂盒。实验例：用实施例1、实施例2、实施例3的制备的试剂盒来测试苯并黄素的急性毒性。试剂盒的使用方法为：所述的试剂盒的使用方法为：在28℃的环境下，将胚胎瓶4中的斑马鱼胚胎用胚胎培养液清洗两遍，移取胚胎至加有胚胎培养液的培养皿5中，每孔10胚胎，将待测溶剂及对比实验溶剂分别装入24孔板的测试瓶中，打开吸管9，将待测溶剂及对比实验溶剂分别吸入对应的胚胎培养皿5中，将培养皿5放入恒温培养箱内进行培养，然后在18小时观察记录斑马鱼胚胎发育的畸形率和死亡率，通过判断和对比来确定待测溶剂的急性毒性。分成四组：实验组1、实验组2、实验组3和对照组，其中每组10孔胚胎，实验组1、实验组2、实验组3分别使用实施例1、实施例2、实施例3的制备的试剂盒，给实验组1、2、3来检测苯并黄素溶液急性毒性，对照组使用实施例2制备的试剂盒，加入的待测液为胚胎培养液。苯并黄素母液：以助溶剂DMSO溶解苯并黄素粉末至澄清，用10ml注射器、0.22μm滤器单独过滤两次后，分装至已灭菌的5ml的Eppendorf管，标记母液的名称、浓度、配制时间等信息，储存，备用。苯并黄素工作液：用胚胎培养液配制不同浓度的工作液，要求工作液内所含DMSO最终浓度为0.1％(V/V)。苯并黄素工作液进行试验浓度为：100μM，震荡摇匀，现配现用。在12h后进行观察，测试的数据如下：分组胚胎数量死亡胚胎数量畸形胚胎数量死亡率畸形率实验组1100502850％28％实验组2100523452％34％实验组3100493949％39％对照组1000000结果发现：本发明的试剂盒灵敏度好，可快速的检测出毒性。最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。当前第1页1 2 3